식품의약품안전청공고 제2007-1호

건강기능식품 기준 및 규격 중

전부 개정안 입안예고

2007. 1. 3

식품의약품안전청

식품의약품안전청공고 제2007-1호

건강기능식품 기준 및 규격을 개정함에 있어 국민에게 미리 알려 의견을 듣고자 그 취지 및 주요내용을 행정절차법 제46조의 규정에 의하여 다음과 같이 공고합니다.

2007년 1월 3일

식품의약품안전청장

건강기능식품 기준 및 규격 중

전부 개정안 입안예고

1. 개정이유

식품공전, 식품첨가물공전 및 국제규격과 조화를 이루고 기준․규격의 합리적 개선 및 안전성․기능성을 확보하고자 함.

2. 주요내용

가. 식품공전, 식품첨가물공전 및 국제규격과 조화

나. 건강기능식품 기능성 재평가에 대한 결과 반영

다. 건강기능식품을 일관성 있게 정의, 기능성 내용, 일일 섭취량, 섭취 시 주의사항, 규격 순으로 재구성

라. 섭취량으로 규정함으로써 여러 가지 유형의 제품을 제조․생산할 수 있는 기반 마련

마. 건강기능식품공전 총칙분야 등과 원료구성 체계 재구축

바. 혼재되어 있는 시험법을 별도로 분리하여 편리하게 사용하도록 편집

3. 참고사항

가. 관계법령 : 건강기능식품에 관한 법률 제14조, 제15조, 제19조

나. 규제심사 :

다. 예    산 : 별도조치 필요없음

라. 합    의 :

4. 의견제출

이 개정(안)에 대하여 의견이 있는 단체 또는 개인은 2007년 1월 23일까지 다음 사항을 기재한 의견서를 식품의약품안전청장(참조 : 건강기능식품규격팀장, 주소 : 서울특별시 은평구 녹번동 5번지, 전화 : 380-1317~9, 팩스 : 380-1320)에게 제출하여 주시기 바라며, 더 자세한 내용을 알고 싶으신 분은 식품의약품안전청 홈페이지 (http ://www.kfda.go.kr)를 참고하시기 바랍니다.

가. 예고사항에 대한 항목별 의견(찬․반 여부와 그 사유)

나. 성명(단체의 경우 단체명과 대표자의 성명), 주소 및 전화번호

건강기능식품 기준 및 규격 중 전부 개정안

건강기능식품 기준 및 규격을 다음과 같이 전부 개정한다.

Ⅰ. 건강기능식품 기준 및 규격

목 차

제 1장 총칙
제 2장 공통기준 및 규격
	1. 일반원칙
	2. 제조기준
	3. 공통 규격
	4. 보존 및 유통기준
제 3장 건강기능식품의 기준 및 규격 적용
	1. 일반원칙
	2. 공통 규격
	3. 기준 및 규격의 적용
	4. 기준 및 규격의 적부 판정
	5. 수출용 건강기능식품의 기준 및 규격
제4장 건강기능식품별 기준 및 규격
	Ⅰ. 단백질류
		1. 단백질
		2. 대두단백
		3. 로얄젤리
		4. 아미노산류
		5. 자라분말
	Ⅱ. 지질류
		1. 감마리놀레산
		2. 레시틴
		3. 배아유
		4. 뱀장어유
		5. 식물스테롤/식물스테롤에스테르
		6. 스쿠알렌
		7. 알콕시글리세롤
		8. 옥타코사놀
		9. 에이코사펜타엔산(EPA)/도코사헥사엔산(DHA)
		10. 자라유
		11. 지방산류
		12. 포도씨유

	Ⅲ. 탄수화물류
		1. 글로코사민
		2. 뮤코다당․단백
		3. 식이섬유
		4. 키토올리고당
		5. 키토산
		6. 프락토올리고당
	Ⅳ. 비타민류 및 무기질류
		1. 베타카로틴
		2. 비타민류
		3. 무기질류
	Ⅴ. 식물류
		1. 녹차추출물
		2. 매실추출물
		3. 배아
		4. 알로에
		5. 인삼
		6. 엽록소
		7. 홍삼
	Ⅵ. 발효미생물류
		1. 식물추출발효
		2. 프로바이오틱스
		3. 홍국
		4. 효모
		5. 효소
	Ⅶ. 조류
		1. 스피루니나
		2. 클로렐라
	Ⅷ. 기타
		1. 버섯류
		2. 화분
		3. 프로폴리스추출물

제5장 검체의 채취 및 취급
	1. 검체의 채취 및 취급의 의의
	2. 용어의 정의
	3. 검체 채취의 일반원칙
	4. 검체의 채취 및 취급 요령
	5. 검체 채취 기구 및 용기
제6장 부표
	1. 영양소기준치
	2. 한국인의 1일 영양권장량

제1장 총 칙

이 공전에서 따로 규정한 것 이외에는 원칙적으로 이하의 총칙에 의한다.

1. 이 공전의 수록범위는 다음 각 호와 같다.

1) 건강기능식품에 관한 법률 제14조의 규정에 의한 건강기능식품의 제조․사용 및 보존 등에 관한 기준 및 규격

2) 건강기능식품에 관한 법률 제15조의 규정에 의한 건강기능식품의 원료 또는 성분(이하 “원료 등”이라 한다.)

3) 건강기능식품에 관한 법률 제17조의 규정에 의한 건강기능식품의 표시기준

2. 이 공전에서 인정하는 건강기능식품과 관련한 공전의 범위는 다음 각 호와 같다.

1) 식품위생법 제7조제1항, 제9조제1항 및 제10조에 의한 식품공전

2) 식품위생법 제7조제1항에 의한 식품첨가물공전

3. 건강기능식품에 관한 법률 제14조제2항 및 제15조제2항의 규정에 의거 건강기능식품공전에 등재되지 않은 건강기능식품으로 인정받은 것에 대하여 다음 각호의 어느 하나를 충족하면 건강기능식품공전에 등재할 수 있다.

1) 국내․외 학술지에 게재된 논문을 사용하여 그 기능성을 인정받은 경우

2) 1)항에 해당하지 않으나 다음 각호의 어느 하나에 해당하는 경우

(1) 동일 원료로 제조․생산․수입․판매하는 건강기능식품을 인정받은 날부터 2년이 경과하였거나 3개 이상 제조업소에서 제조․생산․수입․판매하는 경우

(2) 건강기능식품에 관한 법률 제14조제2항의 규정에 의거 인정받은 자중 3분의 2가 건강기능식품공전에 등재를 요청하는 경우

(3) 건강기능식품심의위원회에서 건강기능식품공전에 등재하여 관리하여야 한다고 하는 경우

(4) 다만 영업자가 타당한 사유를 제시하는 경우에는 등재하지 않을 수 있음(예: 제조방법, 조성물 등에 대한 특허가 인정된 경우 등)

4. 용어의 정의

1) 건강기능식품 제형의 정의

(1) 정제(tablet)란 일정한 형상으로 압축된 것을 말한다.

(2) 캅셀(capsule)이란 캅셀기제에 충전 또는 피포한 것을 말하며, 경질캅셀과 연질캅셀 두 종류가 있다.

(3) 환(pill)이란 구상(球狀)으로 만든 것을 말한다.

(4) 과립(granule)이란 입상(粒狀)으로 만든 것을 말한다.

(5) 액상(liquid)이란 유동성이 있는 액체상태의 것 또는 액체상태의 것을 그대로 농축한 것을 말한다.

(6) 분말(powder)이란 입자의 크기가 과립제품보다 작은 것을 말한다.

2) “A, B, C 등”은 예시 개념으로 일반적으로 많이 사용하는 것을 기재하고 그 외에 관련된 것을 포괄하는 개념이다.

3) “A 또는 B”는 “A나 B”, “A 단독” 또는 “B 단독”으로 해석할 수 있으며, “A, B, C 또는 D” 역시 그러하다.

4) “A 및 B”는 A와 B를 동시에 만족하여야 하며, ꡒA, B 및 Cꡓ 역시 그러하다.

5) “A ～ B”는 A이상 B이하를 뜻한다.

제2장 공통기준 및 규격

1. 일반원칙

1) 기능성 원료

(1) “기능성 원료”라 함은 건강기능식품의 제조에 사용되는 기능성을 가진 원료 또는 성분으로서 동물․식물․조류․미생물 원료, 이들의 추출물․정제물, 비타민․무기질, 대사산물, 이들을 합성한 물질, 혹은 이들의 복합물 등임

(2) 기능성 원료의 범위는 다음과 같다.

가) 이 공전 제3. 건강기능식품별 기준 및 규격에서 정한 것

나) 건강기능식품에 관한 법률 제15조에 의한 “건강기능식품 기능성 원료 인정에 관한 규정”(식품의약품안전청고시)에 따라 인정된 것

다) 식품의약품안전청장이 인정한 기능성 원료를 인정된 섭취량 이상으로 두 가지 이상을 혼합한 것

2) 기능성 원료 이외의 것

(1) 식품공전에서 정한 식품원료

(2) 식품의약품안전청장이 인정한 기능성 원료. 다만 이 경우에는 섭취량 미만으로 사용하여야 한다.

(3) 식품첨가물공전에서 정한 식품첨가물

3) 건강기능식품 제조에 사용되는 원재료의 구비요건

(1) 품질과 선도가 양호하고 부패․변질되지 아니한 것

(2) 유독․유해물질 등에 오염되지 아니한 것

(3) 천연 원재료의 경우에는 흙, 모래, 티끌 등과 같은 이물을 충분히 제거하고 먹는물로 깨끗이 씻어야 하며, 비가식 부분은 충분히 제거하여야 한다.

(4) 허가(신고)대상인 건강기능식품의 원료 등을 구입하여 사용할 때에는 제조업허가를 받았거나 수입신고를 마친 것으로서 해당 기준 및 규격에 적합한 것이어야 하며 유통기한이 경과제품 등 부정․불량한 것을 원료 등으로 사용하여서는 아니 된다.

(5) 기준 및 규격이 정하여져 있는 수처리제 등은 그 기준 및 규격에, 주정은 주세법에 의한 품질기준에, 원료소금은 염관리법에, 축산물은 축산물가공처리법에, 용수는 먹는물 관리법에 적합한 것이어야 한다.

2. 제조기준

1) 공통 제조기준

(1) 건강기능식품의 제조에 사용되는 기계‧기구류와 부대시설물은 항시 위생적으로 유지‧관리하여야 한다.

(2) 건강기능식품의 제조에 사용하는 물은 먹는물 관리법에 적합한 것이어야 한다.

(3) 건강기능식품의 제조 중에는 가능한 한 이물의 혼입이나 병원 미생물(살모넬라(Salmonella spp.), 황색포도상구균(Staphylococcus aureus), 장염비브리오균(Vibrio parahaemolyticus), 클로스트리디움 퍼프린젠스(Clostridium perfringens), 리스테리아 모노사이트제네스(Listeria monocytogenes), 대장균 O157:H7 (Escherichia coli O157:H7), 여시니아 엔테로콜리티카(Yersinia enterocolitica), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 캠필로박터 제주니(Campylobacter jejuni), 클로스트리디움 보툴리눔(Clostridium botulinum) 등 식중독균, 결핵균, 탄저균, 브루셀라균 등)에 오염되지 않도록 적절한 예방대책을 강구하여야 하며 최종제품에서 검출되지 않도록 하여야 한다.

(4) 냉동된 원료의 해동은 위생적으로 실시하여야 한다.

(5) 상온에서 장기보존이 어려운 건강기능식품은 제품의 특성에 따라 냉장, 냉동하거나 적정한 방법으로 살균 또는 멸균 처리하여야 한다.

(6) 건강기능식품의 제조 중 열처리, 냉각 또는 냉동 공정은 제품의 기능성, 안전성을 고려하여 적절한 방법으로 실시하여야 한다.

(7) 건강기능식품의 용기를 회수하여 재사용하고자 하는 때에는  깨끗이 세척하여 일체의 불순물 등이 잔류하지 아니하여야 한다.

(8) 건강기능식품은 용기 또는 포장에 넣어 가능한 한 신속하게 포장하고, 미생물의 오염이 방지되도록 위생적으로 포장하여야 한다.

2) 기능성 원료의 추출 또는 분리 등의 제조과정 중에 사용하는 용매로는 관련법령 및 관련공정서의 규격에 적합한 물, 주정, 아세톤, 이소프로필알콜, 헥산, 이산화탄소, 초산에틸을 사용할 수 있다. 이 중 ‘제3. 건강기능식품별 기준 및 규격’에서 정한 건강기능식품의 제조에 사용하는 추출용매는 물, 주정, 헥산에 한한다.

3) 건강기능식품의 방사선 조사기준

(1) 사용방사선의 선원 및 선종은 Co-60의 감마선으로 한다.

(2) 건강기능식품의 발아억제, 살충, 살균 및 숙도조절의 목적에 한하여, 건강기능식품에 방사선을 조사할 경우 다음의 기준에 적합하여야 한다.

가) 허용대상 건강기능식품별 흡수선량

허용대상	흡수선량
효모, 효소	7KGy이하
알로에분말	7KGy이하
인삼, 홍삼	7KGy이하
클로렐라, 스피루리나	7KGy이하

(3) 일단 조사한 건강기능식품을 다시 조사하여서는 아니 되며 조사된 건강기능식품을 원료로 사용하여 제조‧가공한 건강기능식품도 다시 조사하여서는 아니 된다.

(4) 조사한 건강기능식품은 용기에 넣거나 또는 포장한 후 판매하여야 한다.

3. 공통 규격

1) 통‧병조림제품, 레토르트제품, 냉동제품(건강기능식품 중 프로바이오틱스 제외) 등 보존방법에 따른 규격은 식품공전에 따른다.

2) 내용량 규격은 내용량 시험에 적합하여야 한다.

3) 기구 및 용기․포장의 규격

(1) 건강기능식품의 용기․포장은 식품위생법령의 규정에 의한 용기․포장류 제조업 신고를 필한 업소에서 제조한 것이어야 한다.(다만, 그 자신의 제품을 포장하기 위하여 용기․포장류를 직접 제조하는 경우에는 제외한다)

(2) 건강기능식품에 사용하는 기구 및 용기․포장류는 식품공전 제6. 기구 및 용기․포장의 기준 및 규격에 적합한 것이어야 한다.

4) 유해물질의 규격

(1) 건강기능식품의 건전성 및 안전성을 확보하기 위하여 원료 또는 제조공정 중에서 오염 또는 잔류 가능성이 있는 유해물질 중 필요한 항목에 대하여 규격을 설정한다.

(2) 유해물질에 대한 규격은 유해중금속, 미생물, 잔류용매에 대하여 설정하는 것을 원칙으로 한다. 잔류농약, 잔류동물용 의약품, 곰팡이 독소, 방사능 오염 등과 같이 원재료로부터 또는 원료의 제조과정에서 발생할 수 있는 유해물질은 자가품질 검사항목으로 관리할 수 있다.

표1. 유해물질 적용대상 분류

번호	적용대상분류
1	식물, 조류를 단순히 제조․가공한 것
2	식물, 조류를 추출, 분리, 정제한 것
3	동물성 원료를 단순히 제조․가공한 것
4	동물성 원료를 추출, 분리, 정제한 것
5	미생물 자체를 제조․가공한 것
6	미생물 원료에서 추출, 분리, 정제한 것
7	화학적 합성품

표2. 기본설정항목, 대상품목 및 권장규격

항목		권장규격	대상품목	시험법
중금속	납	< 0.18㎍/kg b.w./day	1～7	유해성금속시험법
	총비소	< 2.5㎍/kg b.w./day
	카드뮴	< 0.05㎍/kg b.w./day
	총수은	< 0.035㎍/kg b.w./day
미생물	대장균군	음성	1～7	미생물시험법
	세균수	1g 당 100이하 (액상제품에 한함)
잔류용매	헥산	0.005g/kg이하	2,4,6	식품첨가물공전 (파프리카색소 잔류용매 시험법)
	아세톤	0.003g/kg이하
	이소프로필알콜	0.05g/kg이하
	초산에틸	0.05g/kg이하

표3. 자가품질 검사항목 및 대상품목

항목		권장규격	대상품목	시험법
잔류농약	엔드린	자사관리규격	1,2	농약잔류시험법
	디엘드린
	알드린
	BHC
	DDT
동물용의약품	항생물질	자사관리규격	4,5	동물의약품시험법
	합성항균제
	구충제
	합성홀몬제
산가		자사관리규격	유지형태에 한함	산가시험법
곰팡이 독소		자사관리규격	원재료의 오염이 의심되는 경우에 한함	식품공전 및 국제 공인시험법
방사능오염	131I	300 Bq/Kg, ℓ이하	원재료의 오염이 의심되는 경우에 한함	방사능잠정허용기준시험법
	134Cs+137Cs	370 Bq/Kg, ℓ이하

4. 보존 및 유통기준

1) 모든 건강기능식품은 위생적으로 취급 판매하여야 하며, 그 보관 및 판매장소가 불결한 곳에 위치하여서는 아니 된다. 또한 방서 및 방충관리를 철저히 하여야 한다.

2) 건강기능식품의 취급 장소는 비‧눈 등으로부터 보호될 수 있어야 하며, 인체에 유해한 화공약품, 농약, 독극물 등과 같은 것을 함께 보관하지 말아야 한다.

3) 이물이 혼입되지 않도록 주의하여야 하며 제품의 풍미에 영향을 줄 수 있는 다른 제품과는 분리 보관하여야 한다.

4) 제품은 서늘한 곳에서 보관 유통하여야 하며 상온에서 7일 이상 보존성이 없는 건강기능식품은 가능한 한 냉장 또는 냉동시설에서 보관 유통하여야 한다.

5) 냉동제품은 품질변화가 최소화할 수 있도록 냉동시켜야 한다. 녹은 냉동제품을 재냉동 시켜서는 아니 된다.

6) 냉동 또는 냉장제품의 운반은 적절한 온도를 유지할 수 있는 냉동 또는 냉장차량이거나 이와 동등 이상의 효력이 있는 방법으로 한다.

7) 흡습의 우려가 있는 제품은 흡습되지 않도록 주의하여야 한다.

8) 제품의 운반 및 포장과정에서 용기‧포장이 파손되지 않도록 주의하여야 하며 가능한 한 심한 충격을 주지 않도록 하여야 한다.

9) 포장된 건강기능식품은 소분 판매하지 말아야 하며, ‘건강기능식품의 표시기준(식품의약품안전청 고시)’에 적합하지 않거나 표시가 없는 것을 구입하거나 판매하지 말아야 한다.

10) 제조연월일 및 유통기한이 표시된 부분에 다른 인쇄물 등을 부착시키지 말아야 한다.

11) 보관과정중의 부주의로 인하여 부패‧변질 또는 파손된 제품은 판매하여서는 아니 된다.

12) 냉동건강기능식품을 해동시켜 실온 또는 냉장건강기능식품으로 유통시켜서는 아니 되며, 실온 또는 냉장건강기능식품을 냉동시켜 냉동건강기능식품으로 유통시켜서는 아니 된다. 또한, 냉장건강기능식품을 실온에서 유통시켜서는 아니 된다.

제3장 건강기능식품의 기준 및 규격 적용

1. 일반원칙

1) 건강기능식품에 사용되는 기능성 원료 이외의 것은 기능성 원료의 안전성과 기능성이 유지되도록 사용하여야 한다.

2) 건강기능식품의 제조 시에는 ‘우수 건강기능식품 제조기준(식품의약품안전청 고시)’의 적용을 권장한다.

3) 비타민 또는 무기질을 사용할 때에는 ‘제4. 건강기능식품별 기준 및 규격’ 중 비타민류 및 무기질류에서 정한 최대함량기준을 따른다.

4) 건강기능식품에 사용되는 식품첨가물은 식품첨가물공전의 기준 및 규격, 사용기준(비타민, 무기질 및 아미노산은 제외)에 적합하여야 한다. 다만 건강기능식품에 사용할 수 없는 식품첨가물이 그 식품첨가물을 사용할 수 있는 원료에서 유래되었을 경우에는 그 건강기능식품중의 식품첨가물 함유는 원료로부터 이행된 범위 내에서 식품첨가물의 사용기준의 제한을 받지 아니할 수 있다.

2. 공통 규격

1) 보존방법, 내용량, 용기․포장에 관한 규격은 공통기준 및 규격에 적합하여야 한다.

2) 붕해도 규격 설정

(1) 정제제품, 캅셀제품, 환제품, 과립제품에 한하여 적용한다.

(2) 다만, 씹어 먹는 것 또는 물에 녹여 먹는 것은 제외한다. 과립식품은 입도시험에서 35호(500μm)체에 잔류하는 것이 5.0%이하인 것은 제외 한다.

(3) 새로운 기술을 이용하여 제조․생산․수입된 제품은 별도로 적합한 시험방법을 적용할 수 있다.

3. 기준 및 규격의 적용

1) 건강기능식품은 기능성원료를 섭취하기 위한 목적으로 제조되어야 한다.

2) 이 공전 ‘제4. 건강기능식품별 개별 기준 및 규격’에서 정한 기능성원료를 사용하여 제조된 건강기능식품은 그 기능성원료가 해당 정의에 적합하여야 한다.

3) 이 공전의 “제4. 건강기능식품별 개별 기준 및 규격”에 해당하는 건강기능식품과 “건강기능식품 인정에 관한 규정” 또는 “건강기능식품 기능성 원료 인정에 관한 규정”에 의하여 인정받은 건강기능식품의 기준과 규격은 해당 기준 및 규격을 우선 적용하여야 하며, 이 공전의 ‘제1. 총칙’, ‘제2. 건강기능식품의 공통기준 및 규격’. ‘제3. 건강기능식품의 기준 및 규격의 적용’을 함께 적용하는 것을 원칙으로 한다.

4) 기능성 원료를 둘 이상 섭취량이상으로 혼합한 복합제품의 경우 다음 각호의 기준에 적합하여야 한다.

(1) 복합한 각각의 기능성분(또는 지표성분)

(2) 규격이 중복되는 것은 강한 것을 적용

(3) 중복되지 않는 규격은 모두 적용

5) 비타민류 및 무기질류 제품에 천연에서 유래한 원재료가 비타민 및 무기질의 기능성원료로 사용되는 경우에는 그 원료의 원료명 및 그 비타민 및 무기질의 함량을 병기하여야 한다.

6) 비타민 또는 무기질을 사용한 경우 ‘비타민류 및 무기질류’에서 정한 섭취량에 적합하면 모두 ‘건강기능식품의 표시기준(식품의약품안전청 고시)’에 따라 표시하고, 당해 규격을 적용받아야 한다.

7) 캅셀제품의 규격은 그 내용물에 한하여 적용한다. 다만 미생물규격은 캅셀을 포함하여 적용한다. 또한 식품첨가물인 타르색소, 보존료, 산화방지제는 캅셀에서 유래되어 이행되는 범위 내에서 제한을 받지 아니할 수 있다.

8) 건강기능식품을 시험할 때에는 규격에 해당하는 항목은 모두 실시하며, 기준에 해당하는 항목은 필요한 경우 선별하여 실시하는 것을 원칙으로 한다. 다만, 규격에 해당하는 항목도 필요에 따라 선별하여 시험을 실시할 수 있다.

9) “3. 건강기능식품별 기준 및 규격”에 있는 원료를 이용하여 부형제 등을 섞어 기능성 원료로 제조 또는 수입하고자 하는 경우에는, 해당 건강기능식품별 기준 및 규격에 적합한지를 확인한 후 당해 규격을 적용받아 제조 또는 수입할 수 있다.

4. 기준 및 규격의 적부 판정

1) 건강기능식품은 식품의약품안전청장이 인정한 기준 및 규격에 따라 적합과 부적합(이하 적부라 한다)으로 판정하며, 규격은 최종제품에 대하여 적용한다.

2) 기준 및 규격이 정하여지지 아니한 유해물질(유해중금속 잔류농약 등)에 관한 적부 판정은 관련 공전의 규정을 준용하며, 관련 공전에서도 기준 및 규격이 없는 경우에는 국제식품규격위원회(Codex Alimentarius Commission, CAC 이하 “CAC”) 규정을 준용할 수 있다. 관련 공전 및 CAC에도 없는 경우에는 식품의약품안전청장이 외국의 기준 및 규격, 일일섭취허용량(ADI) 및 건강기능식품의 섭취량 등 해당 물질별 관련 자료를 종합적으로 검토하여 기준 및 규격을 적용할 수 있다.

3) 기준 및 규격의 판정은 식품의약품안전청장이 인정한 시험방법으로 실시하는 것을 원칙으로 하나, 이보다 더 정밀하고 정확하다고 인정되는 경우에는 새로운 방법을 사용할 수 있다. 특히, 미생물 및 독소 등에 대한 시험에는 상품화된 kit 또는 자동화된 분석기기를 사용할 수 있다. 다만, 그 결과가 서로 상이하여 판정이 어려운 경우에는 식품의약품안전청장이 인정한 시험방법을 우선으로 한다.

4) 식품의약품안전청장이 인정한 시험방법이 없는 경우에는 관련 공전,  CAC규정, AOAC(Association of Official Analytical Chemists), PAM (Pesticide Analytical Manual)에 따라 시험할 수 있으며, 다른 법령에 정해져 있거나 국제적으로 통용되는 공인 시험방법도 사용할 수 있다. 다만, 이 경우에는 영업자가 그 시험방법 및 출처를 함께 제시하여야 한다.

5) 시험방법에 의한 결과에 따른 적부판정은 실험치(시험에서 얻은 값)를 규격치(기준 및 규격에서 정한 값, n 자리수)보다 한자리수(n+1)까지 더 구한 후 이를 반올림하고 규격치와 비교하여 판정한다.

6) 기준 및 규격은 캅셀기제 또는 제피제를 제외한 내용물에 대하여 적용한다. 단, 미생물 시험은 제외한다.

7) “검출되어서는 아니 된다”라 함은 이 공전에 규정된 방법에 의하여 시험하여 검출되지 않는 것을 말한다.

5. 수출용 건강기능식품의 기준 및 규격

수출을 목적으로 하는 건강기능식품의 기준 및 규격은 이 공전의 기준 및 규격에도 불구하고 건강기능식품에 관한 법률 제14조제3항의 규정에 의해 수입자가 요구하는 기준과 규격에 의할 수 있다.

제4장 건강기능식품별 기준 및 규격

Ⅰ. 단백질류

1. 단백질

1) 적용범위

이 기준 및 규격은 일상의 식사에서 부족한 영양소를 보충할 목적으로 섭취하는 건강기능식품에 적용한다.

2) 건강기능식품유형의 정의

단백질이 주원료이며, 이러한 영양소의 보충이 목적인 건강기능식품을 말한다. 식사를 대신하거나 영양소이외의 다른 성분의 섭취가 목적인 것은 제외한다.

3) 원료의 구비요건

(1) 대두, 유류, 난류, 어패류, 육류, 견과류 등에서 단백질을 분리하여 식용에 적합하도록 정제한 것

(2) 상기 ①을 단백분해효소 또는 자가분해효소로 분해하여 얻어진 것

4) 제조기준

(1) 혼합, 충전, 타정시 사용하는 원료는 그 특성에 따른 열, 공기접촉에 의한 산화, 열화, 변질이 되지 않도록 하여야 한다.

(2) 필요한 경우 성분간의 접촉에 의한 변화방지를 위해 원료를 나누어 정제, 캅셀 등으로 제형화할 수 있다.

(3) 부원료로 사용하는 것은 다음에 해당하는 것이어야 한다.

① 이 공전에서 정한 주원료

② 식품공전의 규정에 따라 식품의 주원료로 사용할 수 있다고 인정된 것

(4) 영양소 함량 등에 관한 기준

① 단백질 보충이 목적인 경우, 최종 제품의 단백질의 아미노산 스코아는 85이상이어야 하며 1일 섭취량당 단백질의 함량이 ꡐ제7. 부표ꡑ 1.영양소기준치의 20.0%이상이어야 한다.

- 아미노산 스코아 환산을 위한 기준 필수아미노산 조성표 -

(단위 : mg/g 조단백질)

구 분	히스티딘	이 소 로이신	로이신	라이신	메티오닌＋시스틴	페닐알라 닌＋티로신	트레오닌	트립토판	발린
아미노산 조 성	19	28	66	58	25	63	34	11	35

5) 규격

(1) 성상 : 고유의 색택과 향미를 가지고 이미, 이취가 없어야 한다.

(2) 조단백질(g) : 표시량의 80.0% ～ 120.0%이어야 한다.

(3) 수분(%) : 10.0이하이어야 한다(건조제품에 한한다).

(4) 세균수 : 1ml당 100이하이어야 한다(액상제품에 한한다).

(5) 대장균군 : 음성이어야 한다.

6) 기능성내용

(1) 근육, 결합조직 등 신체조직의 구성성분

(2) 건강증진 및 유지

(3) 단백질 대사균형에 도움

(4) 영양보급

2. 대두단백

1) 정의

(1) 대두에서 단백질을 분리, 정제하여 식용에 적합하도록 한 것

(2) 대두단백 60% 이상 함유

(3) 최종제품은 포화지방, 콜레스테롤, 나트륨의 함량이 높아서는 아니 되며 대두 이외의 동․식물성 단백질 원료를 사용하여서도 아니됨

2) 기능성 내용

건강한 콜레스테롤 수준 유지에 도움

3) 일일 섭취량

대두단백으로서 25.0g 이상

4) 섭취 시 주의사항

대두단백 알레르기가 있는 경우에는 섭취 시 주의가 필요.

5) 규격

(1) 성상 : 고유의 색택․향미를 가지며 이미․이취가 없어야 함

(2) 대두단백(g) : 표시량의 80.0 ~120.0%

(3) 대두단백 확인 : 다이드제인 및 제니스테인이 확인

(4) 수분(%) : 8.0%이하(단, 액상제품 제외)

(5) 조지방(%) : 5.0%이하

(6) 대장균군 : 음성

3. 로얄젤리

1) 적용범위

이 기준 및 규격은 로얄젤리가 주원료이고 로얄젤리의 섭취가 목적인 건강기능식품에 적용한다.

2) 건강기능식품유형의 정의

(1) 생로얄젤리

일벌의 인두선에서 분비되는 분비물로 식용에 적합하도록 이물을 제거한 것을 말한다.

(2) 동결건조로얄젤리

생로얄젤리를 동결건조한 것을 말한다.

(3) 로얄젤리제품

로얄젤리를 주원료(생로얄젤리 35.0%이상, 동결건조로얄젤리 14.0%이상)로 하여 제조․가공한 것을 말한다.

3) 제조기준(기능성분 또는 지표성분의 함량)

(1) 생로얄젤리

최종제품의 10-히드록시-2-데센산(10-HDA)의 함량이 1.6%이상이어야 한다.

(2) 동결건조로얄젤리

최종제품의 10-히드록시-2-데센산(10-HDA)의 함량이 4.0%이상이어야 한다.

(3) 로얄젤리제품

최종제품의 10-히드록시-2-데센산(10-HDA)의 함량이 0.56%이상이어야 한다.

4) 규격

유 형 항 목	생로얄젤리	동결건조로얄젤리	로얄젤리제품
(1) 성상	고유의 색택을 가지고 이미‧이취가 없어야 한다.
(2) 10ꠀ히드록시ꠀ2ꠀ 데센산(%)	표시량이상이어야 한다.
(3) 조단백질(%)	11.0～14.5	30.0～41.0	—
(4) 수분(%)	65.5～68.5	5.0이하	—
(5) 산도 (1N NaOH ml/100g)	32～53	—	—
(6) 대장균	음성이어야 한다.

5) 기능성 내용

(1) 영양보급

(2) 건강증진 및 유지

(3) 고단백식품

4. 아미노산류

1) 적용범위

이 기준 및 규격은 일상의 식사에서 부족한 영양소를 보충할 목적으로 섭취하는 건강기능식품에 적용한다.

2) 건강기능식품유형의 정의

아미노산이 주원료이며, 이러한 영양소의 보충이 목적인 건강기능식품을 말한다. 식사를 대신하거나 영양소이외의 다른 성분의 섭취가 목적인 것은 제외한다.

3) 원료의 구비요건

아미노산은 다음의 필수아미노산이어야 한다.

① 히스티딘

㉮ L-히스티딘(L-Histidine)

㉯ L-히스티딘염산염(L-Histidine Monohydrochloride)

② 이소로이신

㉮ L-이소로이신(L-Isoleucine)

③ 로이신

㉮ L-로이신(L-Leucine)

④ 라이신

㉮ L-라이신(L-Lysine)

㉯ L-라이신염산염(L-Lysine Monohydrochloride)

⑤ 메티오닌

㉮ DL-메티오닌(DL-Methionine)

㉯ L-메티오닌(L-Methionine)

⑥ 시스틴

㉮ L-시스틴(L-Cystine)

⑦ 페닐알라닌

㉮ DL-페닐알라닌(DL-Phenylalanine)

㉯ L-페닐알라닌(L-Phenylalanine)

⑧ 티로신

㉮ L-티로신(L-Tyrosine)

⑨ 트레오닌

㉮ DL-트레오닌(DL-Threonine)

㉯ L-트레오닌(L-Threonine)

⑩ 트립토판

㉮ DL-트립토판(DL-Tryptophan)

㉯ L-트립토판(L-Tryptophan)

⑪ 발린

㉮ L-발린(L-Valine)

4) 제조기준

(1) 혼합, 충전, 타정시 사용하는 원료는 그 특성에 따른 열, 공기접촉에 의한 산화, 열화, 변질이 되지 않도록 하여야 한다.

(2) 필요한 경우 성분간의 접촉에 의한 변화방지를 위해 원료를 나누어 정제, 캅셀 등으로 제형화할 수 있다.

(3) 부원료로 사용하는 것은 다음에 해당하는 것이어야 한다.

① 이 공전에서 정한 주원료

② 식품공전의 규정에 따라 식품의 주원료로 사용할 수 있다고 인정 된 것

(4) 영양소 함량 등에 관한 기준

① 아미노산 보충이 목적인 경우 최종제품의 1일 섭취량당 아미노산의 함량은 아래의 표에서 정한 양이상이어야 하며, 단일 아미노산으로 2.0g이하, 아미노산 총량으로 10.0g이하이어야 한다.

구 분	히스티딘	이 소 로이신	로이신	라이신	메티오닌＋시스틴	페닐알라닌 ＋티로신	트레오닌	트립토판	발린
함량 (mg)	180.0	180.0	250.0	220.0	240.0	250.0	130.0	60.0	180.0

5) 규격

(1) 성상 : 고유의 색택과 향미를 가지고 이미, 이취가 없어야 한다.

(2) 아미노산류(mg) : 표시량의 80.0% ～ 150.0%이어야 한다.

(3) 세균수 : 1ml당 100이하이어야 한다(액상제품에 한한다).

(4) 대장균군 : 음성이어야 한다.

6) 기능성 내용

영양보급

5. 자라분말

1) 적용범위

이 기준 및 규격은 양식한 자라를 식용에 적합하도록 가공한 것을 주원료로 하고 자라성분의 섭취가 목적인 건강기능식품에 적용한다.

2) 건강기능식품유형의 정의

(1) 동결건조자라분말

식용양식자라의 가식부위 전체 또는 일부 지방을 제거한 것을 동결건조하여 분말화한 것을 말한다.

(2) 열풍건조자라분말

식용양식자라의 가식부위 전체 또는 일부 지방을 제거한 것을 열풍건조하여 분말화한 것을 말한다.

(3) 자라분말제품

동결건조자라분말 또는 열풍건조자라분말을 주원료(30.0%이상)로 하여 제조․가공한 것을 말한다.

3) 제조기준(기능성분 또는 지표성분의 함량)

(1) 자라분말

최종제품의 히드록시프롤린의 함량이 동결건조자라분말은 1.0%이상, 열풍건조자라분말은 2.0%이상이어야 한다.

(2) 자라분말제품

최종제품의 히드록시프롤린의 함량이 동결건조자라분말 사용제품의 경우 0.3%이상, 열풍건조자라분말 사용제품의 경우 0.6%이상이어야 한다.

4) 규격

유 형 항 목	자라분말	자라분말제품
(1) 성상	고유의 색택을 가지고 이미‧이취가 없어야 한다.
(2) 히드록시프롤린(%)	표시량이상이어야 한다.
(3) 조단백질(%) ○ 동결건조품 ○ 열풍건조품	48.0～58.0 50.0～70.0	14.0이상 15.0이상
(4) 회분(%) ○ 동결건조품 ○ 열풍건조품	16.0～40.0 20.0～40.0	4.8이상 6.0이상
(5) 수분(%)	5.0이하	10.0이하
(6) 대장균군	음성이어야 한다.

5) 기능성 내용

(1) 영양보급

(2) 건강증진 및 유지

(3) 단백질 공급원

(4) 신체기능의 활성화

(5) 체력증진, 체력보강

Ⅱ. 지질류

1. 감마리놀렌산 함유 유지

1) 정의

(1) 달맞이 꽃(Evening primrose, Oenothera biennis, Oenothera caespitesa, Oenothera hookeri) 종자, 보라지(Borage, Borago officinalis L.) 종자 또는 까막까치밥(Black currant, Ribes grossulalis, Ribes ussuriense, Ribes nigrum) 종자에서 압착, 헥산추출, 또는 초임계추출의 방법을 사용하여 유지성분을 분리하여 식용에 적합하도록 한 것을 말함

(2) 감마리놀렌산 함량이 1g 당 47.5mg 이상 함유되어 있어야 함

(3) 최종제품은 포화지방, 콜레스테롤, 나트륨의 함량이 높아서는 아니됨

2) 기능성 내용

(1) 건강한 콜레스테롤 수준 유지에 도움

(2) 건강한 혈액 흐름에 도움

(3) 필수지방산의 공급원

(4) 생리활성물질 함유

3) 일일 섭취량

감마리놀렌산으로서 240 ~ 300mg

4) 섭취 시 주의사항

(1) 항혈전 의약품을 복용하고 있는 분은 섭취 시 주의

(2) 수술 전에는 섭취를 금함

5) 규격

(1) 성상 : 고유의 색택․향미를 가지고 이미․이취가 없어야 함

(2) 감마리놀렌산(mg) : 표시량의 80.0~120.0%

(3) 리놀레산(%)(달맞이꽃 종자에 한한다) : 57.0이상(달맞이꽃 종자가 100%일 때 57.0이상이며 달맞이꽃 종자의 함유량에 따라 환산하여 적용함)

(4) 산가 : 1.0이하(단, 레시틴, 밀랍 첨가시 5.0 이하)

(5) 과산화물가(meq/kg) : 10.0이하(단, 레시틴, 밀랍 첨가시 15.0 이하)

(6) 대장균군 : 음성

(7) 잔류용매 : 헥산을 사용하는 경우 0.005g/kg이하

2. 레시틴

1) 정의

(1) 두유 또는 난황에서 분리한 인지질 함유한 복합지질을 식용에 적합하도록 처리하거나 이를 원료로 하여 제조․가공한 것

(2) 인지질을 50%이상 함유하고 있어야 하며 대두레시틴의 경우 인지질 중 포스파티딜콜린이 10.0% 이상, 난황레시틴의 경우 인지질 중 포스파티딜콜린이 60.0% 이상 함유되어 있어야 함

(3) 최종제품은 포화지방, 콜레스테롤, 나트륨의 함량이 높아서는 아니되며, 난황레시틴에는 콜레스테롤이 1.0% 이하로 함유되어 있어야 함

2) 기능성 내용

(1) 건강한 콜레스테롤 수준 유지에 도움

(2) 두뇌영양공급

(3) 항산화작용

(4) 혈행을 원활히 하는데 도움

3) 일일 섭취량

레시틴으로서 1.2 ~ 10g

4) 섭취시 주의사항

장기간 과량 섭취 시 간기능 저하 및 메스꺼움, 구토, 설사 등의 부작용이 있을 수 있음

5) 규격

(1) 성상 : 고유의 색택․향미를 가지며 이미․이취가 없어야 함

(2) 인지질(%) : 표시량의 80.0~120.0%

(3) 인지질 중 포스파티딜콜린의 함량(%)

① 대두레시틴 : 10.0이상

② 난황레시틴 : 60.0이상

(4) 콜레스테롤(%) : 표시량이하

(5) 수분(%) : 10.0이하 (단, 액상제품 제외)

(6) 산가 : 21.5이하 (레시틴의 양이 60.0%일 때 21.5이하이며 레시틴의 배합량에 따라 환산 적용)

(7) 과산화물가 : 15.0이하

(8) 대장균군 : 음성

3. 배아유

1) 적용범위

이 기준 및 규격은 배아유가 주원료이고 배아유의 섭취가 목적인 건강기능식품에 적용한다.

2) 건강기능식품유형의 정의

(1) 배아유

쌀, 밀 등 곡류의 배아에서 채취한 기름을 식용에 적합하도록 정제한 것을 말한다.

(2) 천연토코페롤강화배아유

배아유에 식물성 천연토코페롤을 강화한 것을 말한다.

(3) 배아유제품

배아유를 주원료(50.0%이상)로 하여 제조․가공한 것을 말한다.

(4) 천연토코페롤강화배아유제품

천연토코페롤강화배아유를 주원료(50.0%이상)로 하여 제조․가공한 것을 말한다.

3) 제조기준(기능성분 또는 지표성분의 함량)

(1) 배아유, 천연토코페롤강화배아유

① 최종제품의 리놀레산의 함량이 51.0%이상이어야 한다(단, 쌀배아유는 33.0%이상)

② 최종제품의 감마오리자놀(γ-oryzanol)의 함량이 200.0mg/100g이상이어야 한다(쌀배아유에 한한다).

(2) 배아유제품, 천연토코페롤강화배아유제품

① 최종제품의 리놀레산의 함량이 25.5%이상이어야 한다(단, 쌀배아유제품은 16.5%이상)

② 최종제품의 감마오리자놀(γ-oryzanol)의 함량이 100.0mg/100g이상이어야 한다(쌀배아유제품에 한한다).

4) 규격

유 형 항 목	배아유, 천연토코페롤강화배아유	배아유제품, 천연토코페롤강화배아유제품
(1) 성상	고유의 색택을 가지고 이미‧이취가 없어야 한다.
(2) 리놀레산(%)	표시량이상이어야 한다.
(3) γꠀ오리자놀 (mg/100g)	표시량이상(쌀배아유, 쌀배아유제품에 한한다)
(4) 토코페롤(%)	배아유∶0.2～1.0 천연토코페롤강화배아유∶1.0～10.0	배아유제품∶0.1이상 천연토코페롤강화배아유제품∶0.5이상
(5) 산가	1.0이하	1.0이하(단, 레시틴 또는 밀랍을 함유한 경우 5.0이하)
(6) 과산화물가	15.0이하이어야 한다.
(7) 대장균군	음성이어야 한다.

5) 기능성 내용

영양보급

4. 뱀장어유

1) 적용범위

이 기준 및 규격은 뱀장어유가 주원료이고 뱀장어유의 섭취가 목적인 건강기능식품에 적용한다.

2) 건강기능식품유형의 정의

(1) 뱀장어유제품

뱀장어에서 채취한 기름을 식용에 적합하도록 정제한 것 또는 이를 주원료(98.0%이상)로 하여 캅셀에 충전․가공한 것을 말한다.

3) 제조기준(기능성분 또는 지표성분의 함량)

최종제품의 에이코사펜타엔산(Eicosapentaenoic acid, EPA)의 함량이 1.0%이상, 도코사헥사엔산(Docosahexaenoic acid, DHA)의 함량이 2.0%이상이어야 한다.

4) 규격

(1) 성상∶고유의 색택을 가지고 이미‧이취가 없어야 한다.

(2) 에이코사펜타엔산(EPA, %)∶표시량이상이어야 한다.

(3) 도코사헥사엔산(DHA, %)∶표시량이상이어야 한다.

(4) 산가∶1.0이하이어야 한다.

(5) 과산화물가∶15.0이하이어야 한다.

(6) 요오드가∶90～110이어야 한다.

(7) 대장균군∶음성이어야 한다.

5) 기능성 내용

(1) 건강증진 및 유지

(2) 영양보급

5. 식물스테롤/식물스테롤에스테르

1) 정의

(1) 식물스테롤은 대두유, 옥수수유, 채종유를 생산하기 위한 공정 중 탈취공정 중에 생긴 증류물인 베타-시토스테롤(β-sitosterol), 브라시카스테롤(brassicasterol), 스티그마스테롤(stigmasterol), 캄페스테롤(campesterol)의 혼합물을 식용에 적합하도록 추출 및 정제한 것이거나 이를 식용유지 유래 지방산으로 에스테르화 하거나 이들을 제조․가공한 것

(2) 위의 4가지 식물스테롤 혼합물이 총 90% 이상 함유되어 있어야 하며, 에스테르화한 원료는 식물스테롤에스테르와 유리식물스테롤의 합이 80% 이상 되어야 함. 유리식물스테롤의 함량이 10.0% 이하이어야 함

(3) 최종제품은 포화지방, 콜레스테롤, 나트륨의 함량이 높아서는 아니됨

2) 기능성 내용

건강한 콜레스테롤 수준 유지에 도움

3) 일일 섭취량

식물스테롤로서 800 ~ 3,000mg

4) 섭취 시 주의사항

(1) 식사와 같이 섭취하는 것이 효과적임

(2) 유전질환인 시토스테롤혈증(sitosterolemia), 뇌건성황색종증(cerebrotendinous xanthomatosis)을 가진 사람은 섭취를 삼가는 것이 좋음

(3) 임산부, 수유부는 섭취를 삼가는 것이 좋음

(4) 식물스테롤은 베타-카로틴(β-carotene)의 흡수를 방해할 수 있음

(5) 일일섭취량이 3,000mg을 넘지 않도록 주의가 필요함

5) 규격

(1) 성상 : 고유의 색택․향미를 가지며 이미․이취가 없어야 함

(2) 식물스테롤 함량(mg) : 표시량의 80.0~120.0%

(3) 산가 : 2.0이하이어야 한다.

(4) 수분(%) : 1.0이하이어야 한다.(액상제품은 제외한다)

(5) 세균수 : 1ml당 100이하이어야 한다(액상제품에 한한다).

(6) 대장균군 : 음성이어야 한다.

6. 스쿠알렌

1) 적용범위

이 기준 및 규격은 스쿠알렌이 주원료이고 스쿠알렌의 섭취가 목적인 건강기능식품에 적용한다.

2) 건강기능식품유형의 정의

(1) 스쿠알렌

상어의 간에서 추출한 스쿠알렌성분을 함유한 유지를 정제한 것을 말한다.

(2) 스쿠알렌함유제품

스쿠알렌을 주원료(60.0%이상)로 하여 캅셀에 충전하여 제조한 것을 말한다.

3) 제조기준(기능성분 또는 지표성분의 함량)

(1) 스쿠알렌

최종제품의 스쿠알렌성분의 함량이 98.0%이상이어야 한다.

(2) 스쿠알렌함유제품

최종제품의 스쿠알렌성분의 함량이 60.0%이상이어야 한다.

4) 규격

유 형 항 목	스쿠알렌	스쿠알렌함유제품
(1) 성상	고유의 색택을 가지고 이미‧이취가 없어야 한다.
(2) 스쿠알렌성분(%)	표시량이상이어야 한다.
(3) 산가	1.0이하이어야 한다.	1.0이하이어야 한다. (레시틴 또는 밀랍을 첨가시 5.0이하)
(4) 과산화물가	15.0이하이어야 한다.
(5) 요오드가	360～380	—
(6) 굴절률(20℃)	1.495～1.500	—
(7) 비중(20℃/20℃)	0.855～0.865	—
(8) 대장균군	음성이어야 한다.

5) 기능성 내용

(1) 산소공급의 원활화

(2) 피부건강에 도움

(3) 신진대사 기능

7. 알콕시글리세롤

1) 적용범위

이 기준 및 규격은 알콕시글리세롤함유유지가 주원료이고 알콕시글리세롤의 섭취가 목적인 건강기능식품에 적용한다.

2) 건강기능식품유형의 정의

(1) 알콕시글리세롤함유유지

상어간에서 채취한 알콕시글리세롤 함유유지를 분리하여 식용에 적합하도록 정제한 것을 말한다.

(2) 알콕시글리세롤함유제품

알콕시글리세롤함유유지를 주원료(98.0%이상)로 하여 제조․가공한 것을 말한다.

3) 제조기준(기능성분 또는 지표성분)

최종제품의 알콕시글리세롤의 함량이 18.0%이상이어야 한다.

4) 규격

(1) 성상∶고유의 색택과 향미를 가지고 이미‧이취가 없어야 한다.

(2) 알콕시글리세롤(%)∶표시량이상이어야 한다.

(3) 산가∶1.0이하이어야 한다.

(4) 과산화물가∶15.0이하이어야 한다.

(5) 대장균군∶음성이어야 한다.

5) 기능성 내용

(1) 유아성장에 도움

(2) 건강증진에 도움

(3) 신체저항력 증진

8. 옥타코사놀

1) 적용범위

이 기준 및 규격은 옥타코사놀이 주원료이고 옥타코사놀의 섭취가 목적인 건강기능식품에 적용한다.

2) 건강기능식품유형의 정의

(1) 옥타코사놀

미강, 소맥배아, 사탕수수, 사과과피, 포도과피 등 식용식물에서 추출한 옥타코사놀을 함유한 유지를 식용에 적합하도록 정제한 것을 말한다.

(2) 옥타코사놀함유제품

옥타코사놀을 주원료로 하여 제조․가공한 것을 말한다.

3) 제조기준(기능성분 또는 지표성분)

(1) 옥타코사놀

최종제품의 옥타코사놀성분의 함량이 1.0%이상이어야 한다.

(2) 옥타코사놀함유제품

최종제품의 옥타코사놀성분의 함량이 0.5%이상이어야 한다.

4) 규격

유 형 항 목	옥타코사놀	옥타코사놀함유제품
(1) 성상	고유의 색택을 가지고 이미‧이취가 없어야 한다.
(2) 옥타코사놀성분(%)	표시량이상이어야 한다.
(3) 수분(%)	10.0이하(단, 액상제품은 제외한다)
(4) 산가	1.0이하(조지방함량 20.0%이상인 것에 한한다)	1.0이하(조지방함량 20.0%이상인 것에 한함. 다만, 레시틴, 밀랍을 함유하는 경우 5.0이하)
(5) 과산화물가	15.0이하(조지방함량 20.0%이상인 것에 한한다)
(6) 대장균군	음성이어야 한다.

5) 기능성 내용

(1) 건강증진 및 유지

(2) 지구력 증진

9. 에이코사펜타엔산(EPA)/도코사헥사엔산(DHA)

1) 정의

(1) 식용 가능한 어류, 수서동물, 조류에서 유지를 압착, 헥산을 이용한 추출, 초임계추출의 방법으로 유지를 분리하여 에이코사펜타엔산(EPA), 도코사헥사엔산(DHA)을 함유하도록 제조한 것

(2) 도코사헥사엔산과 에이코사헥사엔산이 단독 또는 합해서 18.0% 이상 함유되어 있어야 함

(3) 에이코사펜타엔산이나 도코사헥사엔산의 함량을 높이기 위한 목적으로 에스테르화 시키는 공정을 사용한 것은 제외함

(4) 최종제품은 포화지방, 콜레스테롤, 나트륨의 함량이 높아서는 아니됨

2) 기능성 내용

(1) 건강한 혈중 중성지방 유지에 도움

(2) 건강한 혈액 흐름에 도움

(3) 두뇌․망막의 구성성분

(4) 두뇌영양공급에 도움

3) 일일 권장섭취량

DHA 또는 EPA로서 500 ~ 2000mg

4) 섭취 시 주의사항

(1) 항혈전 의약품을 복용하고 있는 분은 섭취 시 주의

(2) 수술 전에는 섭취를 금하시기 바람

(3) 일일 섭취량이 2.0g을 넘지 않도록 주의

5) 규격

(1) 성상 : 고유의 색택을 가지고 이미․이취가 없어야 함.

(2) 에이코사펜타엔산 및/내지 도코사헥사엔산(mg) :

표시량의 80.0 ~ 120.0%

(3) 산가 : 1.0이하(단, 레시틴, 밀랍을 첨가한 경우 5.0이하).

(4) 과산화물가 : 15.0이하

(5) 대장균군 : 음성

10. 자라유

1) 적용범위

이 기준 및 규격은 양식한 자라를 식용에 적합하도록 가공한 것을 주원료로 하고 자라성분의 섭취가 목적인 건강기능식품에 적용한다.

2) 건강기능식품유형의 정의

(1) 자라유

식용양식자라에서 채취한 기름을 정제한 것을 말한다.

(2) 자라유제품

자라유를 주원료(98.0%이상)로 하여 제조․가공한 것을 말한다.

3) 제조기준(기능성분 또는 지표성분의 함량)

4) 규격

(1) 성상 : 고유의 색택을 가지고 이미‧이취가 없어야 한다.

(2) 팔밑올레산(%) : 8.0～18.0

(3) 아라키돈산+에이코사펜타엔산(%) : 2.0～8.0

(4) 조지방(%) : 95.0이상

(5) 산가 : 1.0이하

(6) 과산화물가 : 15.0이하

(7) 대장균군 : 음성이어야 한다.

5) 기능성 내용

영양보급

11. 지방산류

1) 적용범위

이 기준 및 규격은 일상의 식사에서 부족한 영양소를 보충할 목적으로 섭취하는 건강기능식품에 적용한다.

2) 건강기능식품유형의 정의

지방산이 주원료이며, 이러한 영양소의 보충이 목적인 건강기능식품을 말한다. 식사를 대신하거나 영양소이외의 다른 성분의 섭취가 목적인 것은 제외한다.

3) 원료의 구비요건

지방산은 리놀레산(Linoleic acid), 리놀렌산(Linolenic acid) 또는 이들을 함유하는 지질이어야 한다.

4) 제조기준

(1) 혼합, 충전, 타정시 사용하는 원료는 그 특성에 따른 열, 공기접촉에 의한 산화, 열화, 변질이 되지 않도록 하여야 한다.

(2) 필요한 경우 성분간의 접촉에 의한 변화방지를 위해 원료를 나누어 정제, 캅셀 등으로 제형화할 수 있다.

(3) 부원료로 사용하는 것은 다음에 해당하는 것이어야 한다.

① 이 공전에서 정한 주원료

② 식품공전의 규정에 따라 식품의 주원료로 사용할 수 있다고 인정된 것

(4) 영양소 함량 등에 관한 기준

① 지방산 보충이 목적인 경우 최종제품의 리놀레산(linoleic acid), 리놀렌산(linolenic acid)의 함량은 단독 또는 두가지를 조합하여 1일 섭취량당 리놀레산은 4.0g이상, 리놀렌산은 0.6g이상되어야 한다.

5) 규격

(1) 성상 : 고유의 색택과 향미를 가지고 이미, 이취가 없어야 한다.

(2) 지방산류(g) : 표시량의 80.0% ～ 120.0%이어야 한다.

(3) 수분(%) : 10.0이하이어야 한다(건조제품에 한한다).

(4) 세균수 : 1ml당 100이하이어야 한다(액상제품에 한한다).

(5) 대장균군 : 음성이어야 한다.

6) 기능성 내용

영양보급

12. 포도씨유

1) 적용범위

이 기준 및 규격은 포도씨유가 주원료이고 포도씨유의 섭취가 목적인 건강기능식품에 적용한다.

2) 건강기능식품유형의 정의

(1) 포도씨유

포도씨에서 채취한 기름을 식용에 적합하도록 정제한 것을 말한다.

(2) 포도씨유제품

포도씨유를 주원료(98.0%이상)로 하여 제조․가공한 것을 말한다.

3) 제조기준(기능성분 또는 지표성분의 함량)

(1) 최종제품의 리놀레산의 함량이 57.0%이상이어야 한다.

(2) 최종제품의 카테친의 함량이 3.0mg/100g이상이어야 한다.

4) 규격

(1) 성상∶고유의 색택과 향미를 가지고 이미‧이취가 없어야 한다.

(2) 리놀레산(%)∶표시량이상이어야 한다.

(3) 카테친(mg/100g)∶표시량이상이어야 한다.

(4) 산가∶1.0이하이어야 한다.

(5) 과산화물가∶15.0이하이어야 한다.

(6) 대장균군∶음성이어야 한다.

5) 기능성 내용

(1) 항산화 작용

(2) 필수 지방산 공급

Ⅲ. 탄수화물류

1. 글루코사민

1) 적용범위

이 기준 및 규격은 글루코사민분말이 주원료이고 글루코사민의 섭취가 목적인 건강기능식품에 적용한다.

2) 건강기능식품유형의 정의

(1) 글루코사민분말

키틴 또는 키토산을 가수분해하여 얻은 단당류로 식용에 적합하도록 처리한 것(염류 포함)을 말한다.

(2) 글루코사민함유제품

글루코사민분말을 주원료로 하여 제조․가공한 것을 말한다.

3) 제조기준(기능성분 또는 지표성분의 함량)

(1) 글루코사민분말

최종제품의 글루코사민의 함량이 글루코사민과 글루코사민염산염은 80.0%이상이어야 하며, 글루코사민황산염은 55.0%이상이어야 한다.

(2) 글루코사민함유제품

최종제품의 글루코사민의 함량이 20.0%이상이어야 한다.

4) 규격

(1) 성상 : 고유의 색택과 향미를 가지고 이미․이취가 없어야 한다.

(2) 글루코사민(%) : 표시량이상이어야 한다.

(3) 수분(%) ① 글루코사민분말 : 1.0이하이어야 한다.

② 글루코사민함유제품 : 10.0이하이어야 한다

(다만, 액상제품은 제외한다).

(4) 납(mg/kg) : 2.0이하이어야 한다.

(5) 대장균군 : 음성이어야 한다.

5) 기능성 내용

(1) 관절 및 연골의 구성성분

(2) 관절 및 연골을 튼튼히 하는데 도움을 줌

(3) 관절 및 연골 건강에 도움

2. 뮤코다당․단백

1) 적용범위

이 기준 및 규격은 뮤코다당․단백이 주원료이고 뮤코다당․단백질의 섭취가 목적인 건강기능식품에 적용한다.

2) 건강기능식품유형의 정의

(1) 뮤코다당․단백

소, 돼지, 양, 사슴, 상어, 가금류, 오징어, 게, 어패류 등의 연골조직을 분리, 정선한 후 열수 추출 또는 효소분해하여 여과, 농축, 건조 등의 공정을 거쳐 식용에 적합하도록 정제하여 건조한 것을 말한다.

(2) 뮤코다당․단백제품

뮤코다당․단백을 주원료(50.0%이상)로 하여 제조․가공한 것을 말한다.

3) 제조기준(기능성분 또는 지표성분의 함량)

(1) 뮤코다당․단백

최종제품의 뮤코다당․단백질의 함량이 77.0%이상이어야 한다.

(2) 뮤코다당․단백제품

최종제품의 뮤코다당․단백질의 함량이 50.0%이상이어야 한다.

4) 규격

(1) 성상 : 고유의 색택을 가지고 이미․이취가 없어야 한다.

(2) 뮤코다당․단백질(%) : 표시량이상이어야 한다.

(3) 콘드로이친황산 : 확인되어야 한다.

(4) 단백질과 콘드로이친황산의 비율(단백질/콘드로이친황산) : 3.0이상 9.0미만이어야 한다.

(5) 수분(%) : 8.0이하(다만, 뮤코다당․단백제품중 액상제품, 연질캅셀제품은 제외한다)

(6) 살모넬라 : 음성이어야 한다.

(7) 대장균군 : 음성이어야 한다.

5) 기능성 내용

(1) 연골의 구성성분

(2) 건강증진 및 유지

(3) 영양보급

3. 식이섬유

1) 적용범위

이 기준 및 규격은 일상의 식사에서 부족한 영양소를 보충할 목적으로 섭취하는 건강기능식품에 적용한다.

2) 건강기능식품유형의 정의

단백질, 비타민, 무기질, 아미노산, 지방산, 식이섬유 중 영양소 1종 이상이 주원료이며, 이러한 영양소의 보충이 목적인 건강기능식품을 말한다. 식사를 대신하거나 영양소이외의 다른 성분의 섭취가 목적인 것은 제외한다.

3) 원료의 구비요건

식이섬유는 사람의 소화효소로는 분해되기 어려운 난소화성의 고분자 섬유성분을 식용에 적합하도록 처리한 것을 말한다. 식이섬유원료에는 차전자피, 셀룰로오스, 헤미셀룰로오스, 결정셀룰로오스, 리그닌, 펙틴, 알긴산, 폴리만뉴로닉산, 구아검, 아라비아검, 아라비노갈락탄, 곤약만난, 이눌린, 레반, 폴리덱스트로스, 난소화성말토덱스트린 등이 있다.

4) 제조기준

(1) 혼합, 충전, 타정시 사용하는 원료는 그 특성에 따른 열, 공기접촉에 의한 산화, 열화, 변질이 되지 않도록 하여야 한다.

(2) 필요한 경우 성분간의 접촉에 의한 변화방지를 위해 원료를 나누어 정제, 캅셀 등으로 제형화할 수 있다.

(3) 부원료로 사용하는 것은 다음에 해당하는 것이어야 한다.

① 이 공전에서 정한 주원료

② 식품공전의 규정에 따라 식품의 주원료로 사용할 수 있다고 인정된 것

(4) 영양소 함량 등에 관한 기준

① 식이섬유 보충이 목적인 경우 최종제품의 1일 섭취량당 식이섬유의 함량이 5.0g이상이어야 한다.

5) 규격

(1) 성상 : 고유의 색택과 향미를 가지고 이미, 이취가 없어야 한다.

(2) 식이섬유(g) : 표시량의 80.0% ～ 120.0%이어야 한다.

(3) 수분(%) : 10.0이하이어야 한다(건조제품에 한한다).

(4) 세균수 : 1ml당 100이하이어야 한다(액상제품에 한한다).

(5) 대장균군 : 음성이어야 한다.

6) 기능성 내용

(1) 배변활동 원활

(2) 체중감량에 도움

(3) 지방흡수 저하

(4) 지방합성 저해, 체지방 분해(단, 가르시니아캄보지아껍질 추출물 함유 시)

7) 주의사항

과량 섭취 시 복부팽만감을 느낄 수 있습니다.

4. 키토올리고당

1) 정의

(1) 갑각류(게, 새우 등)의 껍질, 연체류(오징어, 갑오징어 등)의 뼈를 탈단백, 탈칼륨화하여 키틴(N-아세틸글루코사민의 β-1.4 결합 중합체)을 얻은 후 다시 이 원료를 탈아세틸화하여 얻은 키토산에  효소를 처리하여 제조한 올리고당을 말함

(2) 키토올리고당을 50.0% 이상 함유하고 있어야 함

(3) 최종제품은 포화지방, 콜레스테롤, 나트륨의 함량이 높아서는 아니됨

2) 기능성 내용

(1) 건강한 콜레스테롤 수준 유지에 도움

(2) 항균작용

(3) 면역력 증강 기능

3) 일일 섭취량

키토올리고당으로서 1.2 ~ 4.5g

4) 섭취 시 주의사항

(1) 과량 섭취 시 복부팽만을 느낄 수 있음

(2) 갑각류에 알레르기를 가지신 분은 주의하시기 바람

(3) 장기간 섭취할 경우 지용성비타민의 부족을 초래할 수 있음

5) 규격

(1) 성상 : 고유의 색택․향미를 가지고 이미․이취가 없어야 함

(2) 키토올리고당(g) : 표시량의 80.0~120.0%.

(3) 수분(%) : 10.0이하(다만, 액상제품은 제외)

(4) 납(mg/kg) : 2.0이하

(5) 대장균군 : 음성

5. 키토산

1) 정의

(1) 갑각류(게, 새우 등)의 껍질, 연체류(오징어, 갑오징어 등)의 뼈를 탈단백, 탈칼륨화하여 키틴(N-아세틸글루코사민의 β-1.4 결합 중합체)을 얻은 후 다시 이 원료를 탈아세틸화하여 얻은 원료

(2) 탈아세틸화도(당 사슬 중에 글루코사민 잔기 비율)가 80% 이상 되어야 하며, 키토산(글루코사민으로서) 80% 이상 함유되어 있어야 함

(3) 제조에 사용된 제조 용제는 잔류하지 않아야 함

(4) 최종제품은 포화지방, 콜레스테롤, 나트륨의 함량이 높아서는 아니됨

2) 기능성 내용

(1) 건강한 콜레스테롤 수준 유지에 도움

(2) 항균작용

(3) 면역력 증강 기능

3) 일일 섭취량

키토산으로서 1.2 ~ 4.5g

4) 섭취 시 주의사항

(1) 과량 섭취 시 복부팽만을 느낄 수 있음

(2) 갑각류에 알레르기를 가지신 분은 주의하시기 바람

(3) 장기간 섭취할 경우 지용성비타민의 부족을 초래할 수 있음

5) 규격

(1) 성상 : 고유의 색택․향미를 가지고 이미․이취가 없어야 함

(2) 키토산(g) : 표시량의 80.0~120.0%

(3) 수분(%) : 10.0이하(다만, 액상제품은 제외)

(4) 납(mg/kg) : 2.0이하

(5) 대장균군 : 음성

6. 프락토올리고당

1) 정의

(1) 설탕분자에 1개에서 3개의 과당분자가 β-1,2 결합된 올리고당류로서 설탕을 녹여서 당액을 만든 후 전이효소 또는 전이효소를 가진 미생물을 사용하여 제조․가공하거나 이눌린(inuline)을 효소로 가수분해하여 제조․가공한 것

(2) 프락토올리고당의 함량(1-케이스토즈(GF2), 니스토즈(GF3), 프락토퓨라노실니스토즈(GF4)를 합한량)이 50%이상 함유되어 있어야 함

2) 기능성 내용

(1) 장내 비피더스균의 증식 및 유해균의 성장억제에 도움

(2) 배변활동을 원활히 하는데 도움

(3) 칼슘 흡수에 도움

3) 일일 섭취량

프락토올리고당으로서 3.0 ~ 8.0g

4) 섭취 시 주의사항

과량 섭취 시 복부팽만감, 설사를 유발할 수 있음

5) 규격

(1) 성상 : 고유의 색택․향미를 가지며, 이미․이취가 없어야 함

(2) 프락토올리고당 함량(g) : 표시량의 80.0~120.0%

(3) 수분(%) : 10.0이하(다만, 액상제품은 제외).

(4) 납(mg/kg) : 1.0이하

(5) 세균수 : 1ml당 100이하

(6) 대장균군 : 음성

Ⅳ. 비타민류 및 무기질류

1. 베타카로틴

1) 정의

(1) 수중에서 증식하는 식용조류(藻類)(두나리엘라, 클로레라, 스피루리나), 식용녹엽식물(종자, 과실포함), 당근으로부터 베타카로틴을 식용에 적합하도록 추출한 것

(2) 베타카로틴을 2.0~50.0mg/g 함유하고 있어야 함

(3) 합성 베타카로틴을 원료로 사용할 수 없음

2) 기능성 내용

(1) 비타민A의 전구체

(2) 항산화작용

(3) 비타민A는 눈의 간상세포에서 물체를 볼 수 있게 해주는 색소(로돕신)를 합성하는데 필요함

(4) 눈의 영양 공급

(5) 피부건강 유지

3) 일일 섭취량

베타카로틴으로서 1.26mg 이상

4) 섭취 시 주의사항

장기간 과량 섭취 시 피부색깔이 노랗게 변할 수 있음

5) 규격

(1) 성상 : 고유의 색택․향미를 가지며, 이미․이취가 없어야 함

(2) 베타카로틴(mg) : 표시량의 80.0~150.0%

(3) 총페오포르바이드(mg/100g) : 80.0이하(다만, 당근에서 추출한 베타카로틴은 제외)

(4) 산가 : 5.0이하(조지방함량 20.0%이상인 것에 함)

(5) 과산화물가 : 15.0이하(조지방함량 20.0%이상인 것에 한함. 다만, 레시틴을 함유한 경우 30.0 이하이어야 함)

(6) 대장균군 : 음성이어야 한다.

2. 비타민류

1) 적용범위

이 기준 및 규격은 일상의 식사에서 부족한 영양소를 보충할 목적으로 섭취하는 건강기능식품에 적용한다.

2) 건강기능식품유형의 정의

비타민이 주원료이며, 이러한 영양소의 보충이 목적인 건강기능식품을 말한다. 식사를 대신하거나 영양소이외의 다른 성분의 섭취가 목적인 것은 제외한다.

3) 원료의 구비요건

(1) 건강기능식품의 원료에 존재하는 비타민 또는 비타민을 추출․분리한 것

(2) 비타민 A

① 레티닐 팔미트산염(Retinyl Palmitate)

② 베타-카로틴(Beta-Carotene)

③ 분말비타민 A(Dry Formed Vitamin A)

④ 유성비타민 A지방산에스테르(Vitamin A in Oil)

(3) 비타민 B1

① 디벤조일티아민(Dibenzoyl Thiamine)

② 디벤조일티아민염산염(Dibenzoyl Thiamine Hydrochloride)

③ 비타민 B1나프탈린-1,5-디설폰산염(Thiamine Naphthalene-1,5-Disulfonate)

④ 비타민 B1나프탈린-2,6-디설폰산염(Thiamine Naphthalene-2,6-Disulfonate)

⑤ 비타민 B1라우릴황산염(Thiamine Dilaurylsulfate)

⑥ 비타민 B1로단산염(Thiamine Thiocyanate)

⑦ 비타민 B1염산염(Thiamine Hydrochloride)

⑧ 비타민 B1질산염(Thiamine Mononitrate)

⑨ 비타민 B1프탈린염(Thiamine Phenolphthalinate)

(4) 비타민 B2

① 비타민 B2(Riboflavin)

② 비타민 B2인산에스테르나트륨

(리보플라빈 5‘-인산에스테르나트륨, Riboflavin 5'-Phosphate Sodium)

(5) 비타민 B6

① 피리독신염산염(Pyridoxine Hydrochloride)

(6) 비타민 B12

① 비타민 B12(Cyanocobalamin)

(7) 비타민 C

① 비타민 C(L-Ascorbic acid)

② L-아스코르빈산나트륨(Sodium L-Ascorbate)

③ L-아스코르빈산스테아레이트(L-Ascorbyl Stearate)

④ 아스코르빈산칼륨(Potassium L-Ascorbate)

⑤ 아스코르빈산칼슘(Calcium Ascorbate)

⑥ 아스코르빈산팔미테이트(Ascorbyl Palmitate)

(8) 비타민 D

① 비타민 D2(Ergocalciferol)

② 비타민 D3(Cholecalciferol)

(9) 비타민 E

① D-알파-토코페롤(D-α-Tocopherol Concentrate)

② D-알파-토코페롤(D-α-Tocopherol)

③ DL-알파-토코페롤(DL-α-Tocopherol)

④ D-알파-토코페릴 에시드호박산(D-α-Tocopheryl Acid Succinate)

⑤ D-알파-토코페릴 초산염(D-α-Tocopheryl Acetate)

⑥ DL-알파-토코페릴 초산염(DL-α-Tocopheryl Acetate)

(10) 비타민 K

① 비타민 K1(Phylloquinone, Phytonadione)

(11) 나이아신

① 니코틴산(Nicotinic Acid, Niacin)

② 니코틴산아미드(Nicotinamide, Niacinamide)

(12) 비오틴

① 비오틴(Biotin)

(13) 엽산

① 엽산(Pteroylmonoglutamic Acid, Folic Acid)

(14) 판토텐산

① 판토텐산나트륨(Sodium Pantothenate)

② 판토텐산칼슘(Calcium Pantothenate)

4) 제조기준

(1) 혼합, 충전, 타정시 사용하는 원료는 그 특성에 따른 열, 공기접촉에 의한 산화, 열화, 변질이 되지 않도록 하여야 한다.

(2) 필요한 경우 성분간의 접촉에 의한 변화방지를 위해 원료를 나누어 정제, 캅셀 등으로 제형화할 수 있다.

(3) 부원료로 사용하는 것은 다음에 해당하는 것이어야 한다.

① 이 공전에서 정한 주원료

② 식품공전의 규정에 따라 식품의 주원료로 사용할 수 있다고 인정된 것

(4) 영양소 함량 등에 관한 기준

① 비타민의 보충이 목적인 경우 최종 제품의 1일 섭취량 당 해당 비타민의 최소함량은 ‘제5장 부표’ 1. 영양소기준치의 30.0%이상이어야 한다. 단, 섭취 대상을 특별히 정하는 경우에는 ‘제5장 부표’ 2. 한국인의 1일 영양권장량에서 정한 대상 연령군의 영양권장량의 30.0%이상이어야 하며, 대상 연령군에 해당하는 영양권장량이 2개 이상인 경우 그 중 높은 값을 사용한다.

② 비타민A의 전구체인 베타카로틴(β-carotene)을 비타민 A의 급원으로 사용할 수 있으며, 이 경우 6.0㎍ β-carotene을 1.0㎍ RE로 계산한다.

표 4. 비타민 일일 영양소기준치, 최소 및 최대치

영양소	최소치	기준치	최대치
비타민A(㎍ RE)	210	700	700.0
비타민D(㎍)	1.5	5	5.0
비타민E(㎎α-TE)	3	10	150.0
비타민K(㎍)	16.5	55	-
비타민 B1(mg)	0.3	1.0	25.0
비타민 B2(mg)	0.36	1.2	12.0
비타민 B6(mg)	0.45	1.5	10.0
비타민 B12(㎍)	0.3	1.0	60.0
비타민C(mg)	30	100	1000
나이아신(㎎ NE)	3.9	13	13.0
비오틴(㎍)	9.0	30	500.0
엽산(㎍)	75	250	250.0
판토텐산(mg)	1.5	5	30.0

5) 규격

(1) 성상 : 고유의 색택과 향미를 가지고 이미, 이취가 없어야 한다.

(3) 비타민 A(μg RE) : 표시량의 80.0% ～ 150.0%이어야 한다.

(4) 비타민 B1(mg) : 표시량의 80.0% ～ 180.0%이어야 한다. 단, 함량이 최대함량의 권장기준을 초과하는 제품인 경우 90.0% ～ 150.0%이어야 한다.

(5) 비타민 B2(mg) : 표시량의 80.0% ～ 180.0%이어야 한다. 단, 함량이 최대함량의 권장기준을 초과하는 제품인 경우 90.0% ～ 150.0%이어야 한다.

(6) 비타민 B6(mg) : 표시량의 80.0% ～ 180.0%이어야 한다. 단, 함량이 최대함량의 권장기준을 초과하는 제품인 경우 90.0% ～ 150.0%이어야 한다.

(7) 비타민 B12(μg) : 표시량의 80.0% ～ 180.0%이어야 한다. 단, 함량이 최대함량의 권장기준을 초과하는 제품인 경우 90.0% ～ 150.0%이어야 한다.

(8) 비타민 C(mg) : 표시량의 80.0% ～ 180.0%이어야 한다. 단, 함량이 최대함량의 권장기준을 초과하는 제품인 경우 90.0% ～ 150.0%이어야 한다.

(9) 비타민 D(μg) : 표시량의 80.0% ～ 150.0%이어야 한다.

(10) 비타민 E(mg α-TE) : 표시량의 80.0% ～ 180.0%이어야 한다. 단, 함량이 최대함량의 권장기준을 초과하는 제품인 경우 90.0% ～ 150.0%이어야 한다

(11) 비타민 K(μg) : 표시량의 80.0% ～ 180.0%이어야 한다.

(12) 나이아신(mg NE) : 표시량의 80.0% ～ 180.0%이어야 한다. 단, 함량이 최대함량의 권장기준을 초과하는 제품인 경우 90.0% ～ 150.0%이어야 한다.

(13) 비오틴(μg) : 표시량의 80.0% ～ 180.0%이어야 한다. 단, 함량이 최대함량의 권장기준을 초과하는 제품인 경우 90.0% ～ 150.0%이어야 한다.

(14) 엽산(μg) : 표시량의 80.0% ～ 180.0%이어야 한다. 단, 함량이 최대함량의 권장기준을 초과하는 제품인 경우 90.0% ～ 150.0%이어야 한다.

(15) 판토텐산(mg) : 표시량의 80.0% ～ 180.0%이어야 한다. 단, 함량이 최대함량의 권장기준을 초과하는 제품인 경우 90.0% ～ 150.0%이어야 한다.

(16) 수분(%) : 10.0이하이어야 한다(건조제품에 한한다).

(17) 세균수 : 1ml당 100이하이어야 한다(액상제품에 한한다).

(18) 대장균군 : 음성이어야 한다.

6) 기능성 내용

분 류	기 능 성 내 용
베타카로틴	비타민A의 전구체, 항산화작용, 유해산소의 예방, 피부건강 유지
비타민 A	(1) 어두울 때 시력유지에 필요 (2) 피부와 점막의 형성과 기능유지에 필요 (3) 세포 성장발달에 필요
비타민 B1	(1) 탄수화물 이용에 필요 (2) 신경과 심장의 기능유지에 필요
비타민 B2	(1) 체내 에너지 생성에 도움 (2) 입, 눈 등 점막의 구조 유지에 도움
비타민 B6	(1) 단백질 및 아미노산의 이용에 필요 (2) 정상적 혈중 호모시스테인 수준 유지에 도움
비타민 B12	(1) 엽산의 정상적 대사에 필요 (2) 신경계의 정상적 기능유지에 필요 (3) 정상적 혈중 호모시스테인 수준 유지에 도움
비타민C	(1) 혈관 등 결합조직의 형성과 기능유지에 필요 (2) 철의 흡수에 도움 (3) 항산화 작용을 하여 유해산화물질로부터 세포를 보호하는데 도움
비타민D	(1) 칼슘과 인의 흡수와 이용에 필요 (2) 뼈의 형성과 유지에 필요
비타민E	(1) 항산화 작용을 하여 유해산화물로부터 세포를 보호하는데 도움 (2) 면역기능 유지에 도움
비타민K	(1) 정상적인 혈액응고에 필요 (2) 뼈 구조 유지에 필요
나이아신	(1) 에너지 생성에 필요 (2) 피부와 점막의 형성과 기능유지에 필요 (3) 신경기능에 필요
비오틴	지방, 탄수화물, 아미노산의 대사와 에너지 생성에 필요
엽산	(1) 새로운 세포와 정상적 혈액형성에 필요 (2) 태아 신경관의 정상적인 발달에 필요 (3) 정상적인 혈액의 형성에 필요 (4) 정상적인 혈중 호모시스테인 수준 유지에 도움
판토텐산	지방, 탄수화물, 단백질 대사와 에너지 생성에 필요

3. 무기질류

1) 적용범위

이 기준 및 규격은 일상의 식사에서 부족한 영양소를 보충할 목적으로 섭취하는 건강기능식품에 적용한다.

2) 건강기능식품유형의 정의

무기질이 주원료이며, 이러한 영양소의 보충이 목적인 건강기능식품을 말한다. 식사를 대신하거나 영양소이외의 다른 성분의 섭취가 목적인 것은 제외한다.

3) 원료의 구비요건

(1) 건강기능식품의 원료에 존재하는 무기질 또는 무기질을 추출․분리한 것

(2) 구리

① 글루콘산동(Cupric Gluconate)

② 황산동(Cupric Sulphate)

(3) 마그네슘

① 글루콘산마그네슘(Magnesium Gluconate)

② 산화마그네슘(Magnesium Oxide)

③ 수산화마그네슘(Magnesium Hydroxide)

④ 염화마그네슘(Magnesium Chloride)

⑤ 초산마그네슘(Magnesium Acetate)

⑥ 탄산마그네슘(Magnesium Carbonate)

⑦ 황산마그네슘(Magnesium Sulphate)

(4) 망간

① 글루콘산망간(Manganese Gluconate)

② 염화망간(Manganese Chloride)

③ 황산망간(Manganese Sulphate)

④ 구연산망간(Manganese Citrate)

(5) 몰리브덴

몰리브덴산암모늄(Ammonium Molybdate)

(6) 셀렌

아셀렌산나트륨(Sodium Selenite)

(7) 아연

① 글루콘산아연(Zinc Gluconate)

② 산화아연(Zinc Oxide)

③ 염화아연(Zinc Chloride)

④ 초산아연(Zinc Acetate)

⑤ 탄산아연(Basic Zinc Carbonate)

⑥ 황산아연(Zinc Sulphate)

(8) 요오드

① 요오드나트륨(Sodium Iodide)

② 요오드칼륨(Potassium Iodide)

(9) 철

① 구연산철(Ferric Citrate)

② 구연산철암모늄(Ferric Ammonium Citrate)

③ 글루콘산철(Ferrous Gluconate)

④ 인산철(Ferric Phosphate)

⑤ 젖산철(Ferrous Lactate)

⑥ 푸마르산제일철(Ferrous Fumarate)

⑦ 피로인산제이철(Ferric Pyrophosphate)

⑧ 피로인산철나트륨(Sodium Ferric Pyrophosphate)

⑨ 황산제일철(Ferrous Sulphate)

⑩ 헴철(Heme Iron)

⑪ 염화제이철(Ferric Chloride)

(10) 칼륨

① 구연산칼륨(Potassium Citrate)

② 글루콘산칼륨(Potassium Gluconate)

③ 글리세로인산칼륨(Potassium Glycerophosphate)

④ 염화칼륨(Potassium Chloride)

⑤ 젖산칼륨(Potassium Lactate)

⑥ 탄산수소칼륨(Potassium Bicarbonate)

⑦ 탄산칼륨(Potassium Carbonate)

(11) 칼슘

① 우골․어골․패각․난각․해조․유청․풍화퇴적산호․상어연골․성게껍질․오징어연골․불가사리껍질, 기타 건강기능식품의 원료를 식용에 적합하도록 선별․분리한 후 건조 또는 소성하여 분말로 한 것

② 우골․어골․패각․난각․해조․유청․풍화퇴적산호․상어연골․성게껍질․오징어연골․불가사리껍질, 기타 건강기능식품원료의 발효생성유기산칼슘을 식용에 적합하도록 선별․분리한 후 건조 또는 소성하여 분말로 한 것

③ 구연산칼슘(Calcium Salts of Citric acid)

④ 글루콘산칼슘(Calcium Gluconate)

⑤ 글리세로인산칼슘(Calcium Glycerophosphate)

⑥ 산화칼슘(Calcium Oxide)

⑦ 수산화칼슘(Calcium Hydroxide)

⑧ 염화칼슘(Calcium Chloride)

⑨ 젖산칼슘(Calcium Lactate)

⑩ 제삼인산칼슘(Calcium Phosphate, Tribasic)

⑪ 제이인산칼슘(Calcium Phosphate, Dibasic)

⑫ 제일인산칼슘(Calcium Phosphate, Monobasic)

⑬ 탄산칼슘(Calcium Carbonate)

⑭ 황산칼슘(Calcium Sulfate)

(12) 크롬

염화크롬(Chromic Chloride)

4) 제조기준

(1) 혼합, 충전, 타정시 사용하는 원료는 그 특성에 따른 열, 공기접촉에 의한 산화, 열화, 변질이 되지 않도록 하여야 한다.

(2) 필요한 경우 성분간의 접촉에 의한 변화방지를 위해 원료를 나누어 정제, 캅셀 등으로 제형화할 수 있다.

(3) 부원료로 사용하는 것은 다음에 해당하는 것이어야 한다.

① 이 공전에서 정한 주원료

② 식품공전의 규정에 따라 식품의 주원료로 사용할 수 있다고 인정된 것

(4) 영양소 함량 등에 관한 기준

① 무기질의 보충이 목적인 경우 최종제품의 1일 섭취량당 해당 무기질의 최소함량은 ‘제5장 부표’ 1. 영양소의 기준치의 30.0%이상이어야 한다. 단, 섭취 대상을 특별히 정하는 경우에는 ‘제5장 부표’ 2. 한국인의 1일 영양권장량에서 정한 대상 연령군의 영양권장량의 30.0%이상이어야 하며, 대상 연령군에 해당하는 영양권장량이 2개 이상인 경우 그 중 높은 값을 사용한다.

② 1일 섭취량 당 최대함량은 아래 표에서 정한 함량기준 이내로 사용할 것을 권장한다.

영양소	최소치	기준치	최대치
구리(㎎)	0.45	1.5	1.5
마그네슘(㎎)	66	220	220.0
망간(㎎)	0.6	2.0	2.0
몰리브덴(㎍)	7.5	25	25.0
셀렌(㎍)	15	50	50
아연(㎎)	3.6	12	12.0
요오드(㎍)	22.5	75	75.0
철(㎎)	4.5	15	15.0
칼륨(㎎)	1,050	3,500	-
칼슘(㎎)	210	700	700.0
크롬(㎍)	15	50	-

(5) 칼슘함유원료를 사용하여 칼슘원료를 제조할 때 소성(燒成)제품은 가열을 충분히 하여 잔류 유기물질이 없도록 하여야 하고, 비소성제품은 멸균공정을 거쳐야 한다. 소성 또는 건조한 것은 분쇄 및 사별하여야 한다.

5) 규격

(1) 성상 : 고유의 색택과 향미를 가지고 이미, 이취가 없어야 한다.

(2) 구리(mg) : 표시량의 80.0% ～ 180.0%이어야 한다. 단, 함량이 최대함량의 권장기준을 초과하는 제품인 경우 90.0% ～ 150.0%이어야 한다.

(3) 마그네슘(mg) : 표시량의 80.0% ～ 180.0%이어야 한다. 단, 함량이 최대함량의 권장기준을 초과하는 제품인 경우 90.0% ～ 150.0%이어야 한다.

(4) 망간(mg) : 표시량의 80.0% ～ 180.0%이어야 한다. 단, 함량이 최대함량의 권장기준을 초과하는 제품인 경우 90.0% ～ 150.0%이어야 한다.

(5) 몰리브덴(μg) : 표시량의 80.0% ～ 180.0%이어야 한다. 단, 함량이 최대함량의 권장기준을 초과하는 제품인 경우 90.0% ～ 150.0%이어야 한다.

(6) 셀렌(μg) : 표시량의 80.0% ～ 180.0%이어야 한다. 단, 함량이 최대함량의 권장기준을 초과하는 제품인 경우 90.0% ～ 150.0%이어야 한다.

(7) 아연(mg) : 표시량의 80.0% ～ 180.0%이어야 한다. 단, 함량이 최대함량의 권장기준을 초과하는 제품인 경우 90.0% ～ 150.0%이어야 한다

(8) 요오드(μg) : 표시량의 80.0% ～ 180.0%이어야 한다. 단, 함량이 최대함량의 권장기준을 초과하는 제품인 경우 90.0% ～ 150.0%이어야 한다.

(9) 철(mg) : 표시량의 80.0% ～ 180.0%이어야 한다. 단, 함량이 최대함량의 권장기준을 초과하는 제품인 경우 90.0% ～ 150.0%이어야 한다.

(10) 칼륨(mg) : 표시량의 80.0% ～ 180.0%이어야 한다.

(11) 칼슘(mg) : 표시량의 80.0% ～ 180.0%이어야 한다. 단, 함량이 최대함량의 권장기준을 초과하는 제품인 경우 90.0% ～ 150.0%이어야 한다.

(12) 크롬(μg) : 표시량의 80.0% ～ 180.0%이어야 한다.

(13) 수분(%) : 10.0이하이어야 한다(건조제품에 한하며, 수화물(水化物)무기질을 사용한 경우 수분함유부분을 제외하여 계산한다).

(14) 납(mg/kg) : 3.0이하이어야 한다(우골분, 패각분 등 소성칼슘을 사용한 제품에 한한다).

(15) 세균수 : 1ml당 100이하이어야 한다(액상제품에 한한다).

(16) 대장균군 : 음성이어야 한다.

6) 기능성 내용

분 류	내 용
구 리	(1) 뼈나 혈관 등 결합조직 형성에 도움 (2) 철의 운반과 이용에 도움 (3) 항산화작용을 하여 유해산화물질로부터 세포를 보호하는데 도움
마그네슘	(1) 에너지 이용에 필요 (2) 신경과 근육의 기능유지에 필요
망 간	(1) 정상적인 뼈 형성에 도움 (2) 정상적인 에너지 이용에 도움 (3) 항산화작용을 하여 유해산화물질로부터 세포를 보호하는데 도움
몰리브덴	(1) 영양보급
셀 렌	(1) 항산화 작용을 하여 유해산화물질로부터 세포를 보호하는데 도움 (2) 면역기능유지에 필요
아 연	(1) 정상적인 면역기능에 필요 (2) 정상적인 세포분열에 필요 (3) 정상적인 성장에 도움
요 오 드	(1) 갑상선 호르몬 합성에 필요 (2) 신경발달에 필요 (3) 에너지 생성(기초대사 등)에 필요
철	(1) 체내 산소운반과 혈액생성에 필요 (2) 에너지 생성에 도움 (3) 면역기능유지에 필요
칼 륨	(1) 체내 물과 전해질의 균형에 필요 (2) 신경 및 근육세포의 자극전달에 필요
칼 슘	(1) 뼈와 치아의 형성에 필요 (2) 신경과 근육의 기능유지에 필요 (3) 정상적인 혈액응고에 필요
크롬	(1) 영양보급

Ⅴ. 식물류

1. 녹차추출물

1) 정의

(1) 카멜리아 시넨시스(Camellia sinensis, Thea sinensis)의 잎을 물 또는 주정으로 추출․정제한 후 식용에 적합하도록 처리하거나 이를 원료로 하여 제조․가공한 것

(2) 카테킨 함량이 에피칼로카테킨((-)-epigallocatechin, EGC), 에피칼로카테킨갈레이트((-)-epigallocatechin gallate,EGCG), 에피카테킨((-)-epicatechin,EC) 및 에피카테킨갈레이트((-)-epicatechin gallate, ECG) 합계량으로 20.0% 이상이어야 함

(3) 카페인 함량이 5.0% 이하이어야 하며 액상제품의 경우 고형분 중 5.0%이하이어야 함

2) 기능성 내용

항산화 작용

3) 일일 섭취량

에피칼로카테킨, 에피칼로카테킨갈레이트, 에피카테킨 및 에피카테킨갈레이트의 합계로 300 ~1,000mg

4) 섭취 시 주의사항

(1) 과량섭취 시 초조감, 불면 등을 유발할 수 있음

(2) 카페인이 다량 함유되어 있는 다른 제품을 섭취하고 있는 경우 주의하여야 함

5) 규격

(1) 성상 : 고유의 색택․향미를 가지며, 이미․이취가 없어야 함

(2) 카테킨 함량(mg) : 표시량의 80.0~120.0%

(3) 카페인 함량(mg) : 표시량이하

(4) 수분(%) : 5.0이하(다만, 액상제품은 제외)

(5) 세균수 : 1ml당 100이하(액상제품에 한함)

(6) 대장균군 : 음성

2. 매실추출물

1) 적용범위

이 기준 및 규격은 매실추출물이 주원료이고 매실추출물의 섭취가 목적인 건강기능식품에 적용한다.

2) 건강기능식품유형의 정의

(1) 매실추출물

매실의 과즙을 식용에 적합하도록 여과, 농축한 것으로서 고형분이 20.0%이상인 것을 말한다.

(2) 매실추출물제품

매실추출물을 주원료(50.0%이상)로 하여 제조․가공한 것을 말한다.

3) 제조기준(기능성분 또는 지표성분의 함량)

최종제품의 유기산의 산도(함량)가 4.5%이상(구연산으로서)이어야 한다.

4) 규격

(1) 성상∶고유의 색택을 가지며 이미‧이취가 없어야 한다.

(2) 유기산산도(%)∶표시량이상이어야 한다(구연산으로서).

(3) 수분(%)∶15.0이하이어야 한다(단, 액상제품은 제외한다).

(4) 시안화합물∶검출되어서는 아니된다.

(5) 타르색소∶검출되어서는 아니된다.

(6) 대장균군∶음성이어야 한다.

5) 기능성내용

(1) 유해균의 번식억제

(2) 피로회복에 도움

(3) 유기산 작용

(4) 알칼리성 생성식품

3. 배아

1) 적용범위

이 기준 및 규격은 배아가 주원료이고 배아의 섭취가 목적인 건강기능식품에 적용한다.

2) 건강기능식품유형의 정의

(1) 쌀배아

쌀의 배아를 분리․정선하여 가열 등 식용에 적합하도록 한 것을 말한다.

(2) 밀배아

밀의 배아를 분리․정선하여 가열 등 식용에 적합하도록 한 것을 말한다.

(3) 쌀배아제품

쌀배아를 주원료(50.0%이상)로 하여 제조․가공한 것을 말한다.

(4) 밀배아제품

밀배아를 주원료(50.0%이상)로 하여 제조․가공한 것을 말한다.

(5) 배아혼합제품

쌀배아 및 밀배아를 주원료(합하여 50.0%이상)로 하여 제조․가공한 것을 말한다.

3) 제조기준(기능성분 또는 지표성분)

(1) 쌀배아

① 최종제품의 조단백질의 함량이 18.0%이상이어야 한다.

② 최종제품의 총토코페롤의 함량이 25.0mg/100g이상이어야 한다.

③ 최종제품의 γ-오리자놀의 함량이 80.0mg/100g이상이어야 한다.

(2) 밀배아

① 최종제품의 조단백질의 함량이 28.0%이상이어야 한다.

② 최종제품의 총토코페롤의 함량이 25.0mg/100g이상이어야 한다.

③ 최종제품의 β-토코페롤의 함량이 5.0mg/100g이상이어야 한다.

(3) 쌀배아제품

① 최종제품의 조단백질의 함량이 9.0%이상이어야 한다.

② 최종제품의 총토코페롤의 함량이 12.5mg/100g이상이어야 한다.

③ 최종제품의 γ-오리자놀의 함량이 40.0mg/100g이상이어야 한다.

(4) 밀배아제품

① 최종제품의 조단백질의 함량이 14.0%이상이어야 한다.

② 최종제품의 총토코페롤의 함량이 12.5mg/100g이상이어야 한다.

③ 최종제품의 β-토코페롤의 함량이 2.5mg/100g이상이어야 한다.

(5) 배아혼합제품

① 최종제품의 조단백질의 함량이 9.0%이상이어야 한다.

② 최종제품의 총토코페롤의 함량이 12.5mg/100g이상이어야 한다.

4) 규격

유 형 항 목	쌀배아	밀배아	쌀배아제품		밀배아제품	배아혼합 제품
(1) 성상	고유의 색택과 향미를 가지고 이미․이취가 없어야 한다.
(2) 조단백질(%)	표시량이상이어야 한다.
(3) 총 토코페롤 (mg/100g)	표시량이상이어야 한다.
(4) βꠀ토코페롤 (mg/100g)	—	표시량이상	—		표시량이상	—
(5) γꠀ오리자놀 (mg/100g)	표시량이상	—	표시량이상		—	—
(6) 수분(%)	8.0이하			8.0이하 (다만, 액상제품은 제외한다)
(7) 대장균군	음성이어야 한다.

6) 기능성내용

(1) 밀배아(제품)

① 항산화작용

② 생리활성성분 함유

③ 신진대사 기능

(2) 쌀배아(제품)

① 영양보급

4. 알로에

1) 정의

(1) 식용알로에(베라, 아보레센스(키타치), 사포나리아) 잎의 겔 성분, 농축물, 비가식 부분을 제거한 후 건조․분말화하거나 착즙한 것 또는 이를 원료로 하여 식용에 적합하도록 제조․가공한 것

(2) 알로인을 함유하고 있어야 하며 알로에베라의 경우에는 만노스와 글루코스를 함유하고 있어야 함. 또한 알로에속 특유의 성분인 β-sitosterol 1-3-0-6-palmitoyl-β-D-glucopyranoside(SPG) 및 β-sitosterol 1-3-0-β-D-glucopyranoside(SG)를 함유하고 있어야 함

(3) 겔을 분리시킨 외피만을 건강기능식품의 원료로 사용할 수 없음

2) 기능성 내용

(1) 장운동에 도움

(2) 면역력 증강기능

(3) 위와 장건강에 도움

(4) 피부건강에 도움(알로에베라)

(5) 배변활동에 도움

3) 일일 섭취량

알로인으로서 20~30mg

알로에베라겔을 함유하는 제품의 경우 알로에베라겔로서 200㎖

4) 섭취 시 주의사항

과량 섭취 시 전해질 균형 장애 등이 있을 수 있으며 급성염증성 장질환, 맹장염, 원인불명의 복통 시 섭취를 금해야 함. 또한 임산부 및 수유부, 12세 이사의 어린이는 섭취를 제한해야 함

5) 규격

(1) 성상 : 고유의 색택과 향미를 가지고 이미․이취가 없어야 함

(2) 알로인(mg) : 표시량의 80.0~120.0%

(3) 만노스 또는 글루코스(mg) : 표시량의 80.0~120.0%

(4) β-sitosterol 1-3-0-6-palmitoyl-β-D-glucopyranoside(SPG) 및 β-sitosterol 1-3-0-β-D-glucopyranoside(SG) (mg) : 표시량의 80.0~120.0%

(5) 수분 : 10.0이하(액상제품은 제외)

(6) 고형분 : 0.5이상(알로에겔에 한하며, 농축액의 경우 농축배수를 고려하여 환산)

(7) 조단백질 : 1.0 이상(알로에겔 제품에 한하며 200:1 알로에겔 분말을 기준으로 환산)

(8) 회분 : 13~40(알로에겔에 한하며 200:1 알로에겔 분말을 기준으로 함), 8~25(알로에분말에 한함)

(9) 조섬유(%) : 7~15(알로에분말에 함)

(10) 무수바바로인(%) : 1.0이하(알로에겔 분말), 0.005 이하(알로에겔에 적용하며, 농축배수 및 함량에 따라 환산 적용한다), 5.0이하(알로에분말)

(11) 대장균군 : 음성.

(12) 세균수 : 1ml당 100이하(다만, 액상제품에 함).

(13) 보존료(g/kg) : 식품첨가물공전에 적합하여야 함

5. 인삼

1) 정의

(1) 인삼(태극삼 포함)근(오가피과 인삼속 식물의 지하부를 말한다)을 그대로 분말화 하거나 물이나 주정 또는 물과 주정을 혼합한 용매로 추출하여 여과한 후 농축하거나 농축한 것을 분말화한 것을 말함

(2) 진세노사이드 Rb1과 Rg1이 확인되어야 하며 인삼성분은 인삼농축액은 80.0mg/g 이상, 인삼농축액분말은 120mg/g 이상, 인삼분말은 20.0mg/g 이상 함유되어 있어야 함

(3) 원료 인삼근은 4년근 이상의 것으로 춘미삼, 묘삼, 삼피, 인삼박은 사용할 수 없으며 병삼인 경우에는 병든 부분을 제거하고 사용할 수 있음

2) 기능성 내용

(1) 면역기능 증진에 도움

(2) 육체적 피로회복에 도움

3) 일일 섭취량

인삼분말로서 2 ~ 4.5g

4) 섭취 시 주의사항

사람에 따라 복부팽만감 등의 불편함을 느낄 수 있음

5) 규격

(1) 성상 : 고유의 색택․향미를 가지며, 이미․이취가 없어야 함

(2) 인삼성분 함량(mg/g) : 표시향의 80.0~120.0%

(3) 인삼성분 확인 : 진세노사이드(Ginsenoside) Rb1 및 Rg1이 확인되어야 함

(4) 고형분(%) : 60.0이상(인삼농축액에 한함)

(5) 수분(%) : 9.0이하

(6) 카라멜색소 : 검출되어서는 아니됨(인삼농축액을 함유하고 있는 제품에 한함)

(7) 물불용성침전물(%) : 3.0이하(인삼농축액에 한함)

(8) 입도(%) : 100메쉬를 통과한 양이 85.0이상(인삼분말에 한함)

(9) 세균수 : 1g당 100이하 (다만, 액상제품에 한함)

(10) 대장균군 : 음성

(11) 잔류농약 : 식품공전 제3. 식품일반에 대한 공통 기준 및 규격6. 기준 및 규격의 적용 5) 인삼의 농약 잔류허용기준에 따름

6. 엽록소

1) 적용범위

이 기준 및 규격은 엽록소가 풍부한 식용 식물류를 식용에 적합하도록 가공한 것을 주원료로 하고 엽록소의 섭취가 목적인 건강기능식품에 적용한다.

2) 건강기능식품유형의 정의

(1) 맥류약엽엽록소원말

보리, 밀, 귀리의 어린 싹 또는 어린 이삭 형성 전의 것을 채취하여 잎의 전부 또는 일부를 그대로 또는 착즙하여 건조분말로 한 것을 말한다.

(2) 알팔파엽록소원말

알팔파의 성숙한 잎, 잎꼭지, 줄기의 전부 또는 일부를 그대로 또는 착즙하여 건조분말로 한 것을 말한다.

(3) 해조류엽록소원말

엽록소를 함유한 식용해조류를 채취하여 전부 또는 일부를 건조분말로 한 것을 말한다.

(4) 기타식물류엽록소원말

엽록소를 함유한 케일 등의 식용식물류(단일식물 100%)를 채취하여 전부 또는 일부를 그대로 또는 착즙하여 건조분말로 한 것을 말한다.

(5) 맥류약엽엽록소함유제품

맥류약엽엽록소원말을 주원료(50.0%이상)로 하여 제조․가공한 것을 말한다.

(6) 알팔파엽록소함유제품

알팔파엽록소원말을 주원료(50.0%이상)로 하여 제조․가공한 것을 말한다.

(7) 해조류엽록소함유제품

해조류엽록소원말을 주원료(50.0%이상)로 하여 제조․가공한 것을 말한다.

(8) 기타식물류엽록소함유제품

기타식물류엽록소원말을 주원료(50.0%이상)로 하여 제조․가공한 것을 말한다.

3) 제조기준(기능성분 또는 지표성분의 함량)

(1) 맥류약엽엽록소원말

최종제품의 총엽록소의 함량이 240.0mg/100g이상이어야 한다.

(2) 알팔파엽록소원말

최종제품의 총엽록소의 함량이 60.0mg/100g이상이어야 한다.

(3) 해조류엽록소원말, 기타식물류엽록소원말

최종제품의 총엽록소의 함량이 120.0mg/100g이상이어야 한다.

(4) 맥류약엽엽록소함유제품

최종제품의 총엽록소의 함량이 120.0mg/100g이상이어야 한다.

(5) 알팔파엽록소함유제품

최종제품의 총엽록소의 함량이 30.0mg/100g이상이어야 한다.

(6) 해조류엽록소함유제품, 기타식물류엽록소함유제품

최종제품의 총엽록소의 함량이 60.0mg/100g이상이어야 한다.

4) 규격

유 형 항 목	맥류약엽엽록소함유제품,맥류약엽엽록소원말	알팔파엽록소함유제품, 알팔파엽록소원말	해조류엽록소함유제품 기타식물류엽록소함유제품 해조류엽록소원말, 기타식물류엽록소원말
(1) 성상	고유의 색택을 가지고 이미‧이취가 없어야 한다.
(2) 총엽록소 (mg/100g)	표시량이상이어야 한다.
(3) 칼슘 (mg/100g)	—	800이상 (알팔파엽록소원말은 1,600이상)	—
(4) 헥사코사놀	확인되어야 한다.	—	—
(5) 에스.오.디(unit/g) (Superoxide dismutase)	400이상	—	—
(6) 단백질응고 시험	양 성	—	—
(7) 총페오포르바이드 (mg/100g)	30.0이하	30.0이하	—
(8) 수분(%)	8.0이하(다만, 액상제품, 연질캅셀제품은 제외한다)
(9) 타르색소	검출되어서는 아니된다.
(10) 대장균군	음성이어야 한다.

5) 기능성내용

(1) SOD 함유

(2) 유해산소의 예방

(3) 피부건강에 도움

(4) 건강증진 및 유지

7. 홍삼

1) 정의

(1) 수삼을 증기나 기타의 방법으로 쪄서 익혀 말린 홍삼을 그대로 분말화 하거나 물이나 주정 또는 물과 주정을 혼합한 용매로 추출하여 여과한 후 농축하거나 농축한 것을 분말화한 것 또는 이들 원료로 하여 제조․가공한 것

(2) 진세노사이드 Rb1과 Rg1이 확인되어야 하며 홍삼성분은 홍삼농축액은 70.0mg/g 이상, 홍삼농축액분말은 105.0mg/g 이상, 홍삼분말은 20.0mg/g 이상 함유되어 있어야 함

(3) 원료 홍삼은 인삼산업법에 적합한 것이어야 함

2) 기능성 내용

(1) 면역기능 증진에 도움

(2) 육체적 피로회복에 도움

3) 일일 섭취량

홍삼분말로서 2 ~ 4.5g

4) 섭취 시 주의사항

사람에 따라 복부팽만감 등의 불편함을 느낄 수 있음

5) 규격

(1) 성상 : 고유의 색택과 향미를 가지며, 이미․이취가 없어야 함

(2) 인삼성분 함량(mg/g) : 표시향의 80.0~120.0%

(3) 인삼성분 확인 : 진세노사이드(Ginsenoside) Rb1 및 Rg1이 확인되어야 함

(4) 고형분(%) : 60.0이상이어야 한다(홍삼농축액에 한한다)

(5) 수분(%) : 8.0이하이어야 한다.

(6) 카라멜색소 : 검출되어서는 아니된다(홍삼농축액을 함유하고 있는 제품에 한한다)

(7) 물불용성침전물(%) : 2.0이하(다만, 홍삼농축액에 한함).

(8) 입도(%) : 100메쉬를 통과한 양이 85.0이상(다만, 홍삼분말에 함)

(9) 세균수 : 1g당 100이하(액상제품에 한함).

(10) 대장균군 : 음성

(11) 잔류농약 : 식품공전 제3. 식품일반에 대한 공통 기준 및 규격6. 기준 및 규격의 적용 5) 인삼의 농약 잔류허용기준에 따름

Ⅶ. 발효미생물류

1. 식물추출발효

1) 적용범위

이 기준 및 규격은 식물추출물발효물이 주원료이고 식물추출물발효물의 섭취가 목적인  건강기능식품에 적용한다.

2) 건강기능식품유형의 정의

채소류, 과일류, 종실류, 해조류 등 식용식물을 압착 또는 당류(설탕, 맥아당, 포도당, 과당 등)의 삼투압에 의해 얻은 추출물을 자체발효 또는 유산균․효모균 등의 접종에 의하여 발효시켜 식용유래성분과 발효생성물을 섭취에 적합하도록 제조․가공한 것을 말한다.

3) 제조기준

(1) 발효에 사용되는 미생물은 안전성이 인정된 것이어야 한다.

(2) 원료에서 유래한 것(종균 포함) 이외의 물, 효모, 유산균, 비타민 등을 첨가하여서는 아니된다.

4) 규격

항목	규격
(1) 성상	고유의 색택과 향미를 가지고 이미, 이취가 없어야 한다.
(2) 유기산 산도 (젖산으로서, %)	0.3이상(젖산으로서)이어야 한다.
(3) 환원당, 효모수, 유산군수, 비타민 B, 비타민B₂중 3가지 이상 적합하여야 한다	① 환원당(%) : 50.0% 이상표시량 이상 ② 효모수 : 1,000,000/g 이상표시량이상 ③ 유산균수 : 1,000,000/g 이상 ④ 비타민B₁(㎎/100g) : 0.2 이상 ⑤ 비타민B₂(㎎/100g) : 0.05 이상
(4)대장균군	음성이어야 한다.
(5) 메탄올(%)	0.01이하이어야 한다.

5) 기능성 내용

(1) 건강증진에 도움

(2) 체질개선

(3) 영양공급원

2. 프로바이오틱스

1) 정의

(1) 다음의 미생물 또는 이를 혼합한 균을 식용에 적합하도록 제조․가공한 것

(2) 원료에는 살아있는 생균이 1g 당 100,000,000CFU 이상 함유되어 있어야 함. 단 2종 이상의 균을 혼합하는 경우에는 1g 당 10,000,000CFU 이상 함유되어 있어야 함

프로바이오틱스	종류
Lactobacillus	L.acidophilus, L.casei, L.gasseri, L.delbrueckii ssp bulgaricus, L.helveticus, L.fermentum, L.paracasei, L.plantarum, L.reuteri, L.rhamnosus, L.salivarius
Lactococcus	Lc. lactis
Enterococcus	E.faecium, E.faecalis
Streptococcus	S.thermophilus
Bifidobacterium	B.bifidum, B.infantis, B.breve, B.longum, B.lactis

2) 기능성 내용

(1) 장내 유익균의 증식 및 유해균의 억제

(2) 배변활동에 도움

3) 일일 권장섭취량

100,000,000CFU 이상

4) 섭취 시 주의사항

과량 섭취 시 복부팽만감 등을 유발할 수 있음

5) 규격

(1) 성상 : 고유의 색택과 향미를 가지며, 이미․이취가 없어야 함

(2) 프로바이오틱스수 : 표시량이상

(3) 대장균군 : 음성

3. 홍국

1) 정의

(1) 쌀(90%이상)에 홍국균(10%이하)을 접종하여 순수 고체발효를 이용하여 식용에 적합하도록 생산한 발효물 또는 이를 제조․가공한 것

(2) 총 모나콜린 K를 0.05% 이상 함유하고 있어야 함

(3) 합성, 분리, 정제된 모나콜린 K(monacolin K)를 사용할 수 없음

(4) 최종제품은 포화지방, 콜레스테롤, 나트륨의 함량이 높아서는 아니됨

2) 기능성 내용

건강한 콜레스테롤 수준 유지에 도움

3) 일일 섭취량

총 모나콜린 K 으로서 4.0 ~ 8.0mg

4) 섭취 시 주의사항

(1) 임산부, 수유부, 간질환 환자, 어린이, 청소년은 섭취를 삼가는 것이 좋음

(2) 복통, 속쓰림, 어지럼증, 복부팽만감이 일어날 수 있음

(3) 콜레스테롤 조절 의약품을 복용하는 환자는 반드시 의사와 상담하여야 함

5) 규격

(1) 성상 : 고유의 색택과 향미를 가지며, 이미․이취가 없어야 함

(2) 총 모나콜린 K 함량(mg) : 표시량의 80.0~120.0%

(3) 활성형 모나콜린 K : 확인되어야 함

(4) 시트리닌(㎍/kg) : 50이하

(5) 수분(%) : 10.0이하(다만, 액상제품은 제외).

(6) 세균수 : 1㎖당 100이하(다만, 액상제품에 한함).

(7) 대장균군 : 음성

4. 효모

1) 적용범위

이 기준 및 규격은 식용효모 또는 식용효모추출물이 주원료이고 효모 또는 효모추출물의 섭취가 목적인 건강기능식품에 적용한다.

2) 건강기능식품유형의 정의

(1) 건조효모

식용 효모균주를 분리, 정제하여 건조한 것을 말한다.

(2) 건조효모제품

건조효모를 주원료(60.0%이상)로 하여 제조․가공한 것을 말한다.

(3) 효모추출물제품

식용 효모균주를 분리, 정제한 후 자가소화, 효소분해, 열수추출 등의 방법에 의해 추출한 식용효모추출물을 주원료(고형분함량으로 30.0%이상)로 하여 제조한 것을 말한다(단, 액상제품은 고형분함량으로 15.0%이상).

3) 제조기준(기능성분 또는 지표성분의 함량)

(1) 건조효모

최종제품의 조단백질의 함량이 40.0%이상이어야 한다.

(2) 건조효모제품

최종제품의 조단백질의 함량이 24.0%이상이어야 한다.

(3) 효모추출물제품

최종제품의 조단백질의 함량이 10.0%이상이어야 한다(단, 액상제품은 조단백질 함량이 5.0%이상).

4) 규격

유 형 항 목	건조효모	건조효모제품, 효모추출물제품
(1) 성상	고유의 색택을 가지고 이미‧이취가 없어야 한다.
(2) 조단백질(%)	표시량이상이어야 한다.
(3) 수분(%)	8.0이하	10.0이하(단, 액상제품은 제외한다)
(4) 세균수	—	1ml당 100이하(액상제품에 한한다)
(5) 대장균군	음성이어야 한다.

5) 기능성내용

(1) 영양의 불균형 개선

(2) 영양공급원

(3) 건강증진 및 유지

(4) 신진대사 기능

5. 효소

1) 적용범위

이 기준 및 규격은 건강기능식품의 원료에 미생물을 배양시켜 효소를 다량 함유하게 한 것을 주원료로 한 건강기능식품에 적용한다.

2) 건강기능식품유형의 정의

(1) 곡류효소함유제품

건강기능식품의 원료(곡류 60.0%이상)에 식용미생물을 배양시킨 것을 주원료(50.0%이상)로 하여 제조․가공한 것을 말한다.

(2) 배아효소함유제품

건강기능식품의 원료(곡물의 배아 40.0%이상)에 식용미생물을 배양시킨 것을 주원료(50.0%이상)로 하여 제조․가공한 것을 말한다.

(3) 과‧채류효소함유제품

건강기능식품의 원료(과‧채류 60.0%이상)에 식용미생물을 배양시킨 것을 주원료(50.0%이상)로 하여 제조․가공한 것을 말한다.

(4) 기타식물효소함유제품

곡류, 곡물배아 또는 과‧채류 이외의 건강기능식품의 원료(식물성 원료 60.0%이상)에 미생물을 배양시킨 것을 주원료(50.0%이상)로 하여 제조․가공한 것을 말한다.

3) 제조기준

(1) 배양에 사용하는 미생물은 안전성이 인정되는 것이어야 한다.

(2) 기능성분 또는 지표성분의 함량

최종제품의 조단백질의 함량이 10.0%이상이어야 한다.

4) 규격

(1) 성상∶고유의 색택을 가지고 이미‧이취가 없어야 한다.

(2) 조단백질(%)∶표시량이상이어야 한다.

(3) αꠀ아밀라아제∶양성이어야 한다.

(4) 프로테아제∶양성이어야 한다.

(5) 수분(%)∶10.0이하이어야 한다(단, 액상제품은 제외한다).

(6) 대장균∶음성이어야 한다.

5) 기능성 내용

(1) 신진대사 기능

(2) 건강증진 및 유지

(3) 연동작용 및 배변에 도움(식이섬유 다량함유시)

(4) 체질개선

Ⅷ. 조류

1. 스피루리나

1) 적용범위

이 기준 및 규격은 스피루리나원말이 주원료이고 스피루리나의 섭취가 목적인 건강기능식품에 적용한다.

2) 건강기능능식품유형의 정의

(1) 스피루리나원말

스피루리나속의 조류(藻類)를 인위적으로 배양하여 가열 등의 방법으로 소화성을 높이도록 처리한 후 건조하여 식용에 적합하도록 한 것을 말한다.

(2) 스피루리나제품

스피루리나원말을 주원료(50.0%이상)로 하여 제조․가공한 것을 말한다.

3) 제조기준

(1) 스피루리나는 순수 배양한 것이어야 한다.

(2) 기능성분 또는 지표성분의 함량

① 스피루리나원말

㉮ 최종제품의 조단백질의 함량이 50.0%이상이어야 한다.

㉯ 최종제품의 엽록소 a의 함량이 500.0mg/100g이상이어야 한다.

② 스피루리나제품

㉮ 최종제품의 조단백질의 함량이 25.0%이상이어야 한다.

㉯ 최종제품의 엽록소 a의 함량이 250.0mg/100g이상이어야 한다.

4) 규격

유 형 항 목	스피루리나원말	스피루리나제품
(1) 성상	고유의 색택을 가지고 이미‧이취가 없어야 한다.
(2) 조단백질(%)	표시량이상이어야 한다.
(3) 엽록소 a(mg/100g)	표시량이상이어야 한다.
(4) 수분(%)	7.0이하	10.0이하 (단, 액상제품은 제외한다)
(5) 회분(%)	12.0이하	—
(6) 총페오포르바이드 (mg/100g)	100.0이하	50.0이하 (스피루리나원말의 양이 50.0%일 때 50.0이하이며, 원말의 배합량에 따라 환산 적용한다)
(7) 타르색소	검출되어서는 아니된다.
(8) 대장균군	음성이어야 한다.

5) 기능성내용

(1) 필수 아미노산의 공급원

(2) 단백질 공급

(3) 영양공급

(4) 생리활성성분 함유

(5) 건강증진 및 유지

2. 클로렐라

1) 적용범위

이 기준 및 규격은 클로렐라원말이 주원료이고 클로렐라의 섭취가 목적인 건강기능식품에 적용한다.

2) 건강기능식품유형의 정의

(1) 클로렐라원말

클로렐라속 조류(藻類)를 인위적으로 배양하여 가열 등의 방법으로 소화성을 높이도록 처리한 후 건조하여 식용에 적합하도록 한 것을 말한다.

(2) 클로렐라제품

클로렐라원말을 주원료(50.0%이상)로 하여 제조한 것을 말한다.

3) 제조기준

(1) 클로렐라는 순수 배양한 것이어야 한다.

(2) 기능성분 또는 지표성분의 함량

① 클로렐라원말

㉮ 최종제품의 조단백질의 함량이 50.0%이상이어야 한다.

㉯ 최종제품의 엽록소의 함량이 1,000mg/100g이상이어야 한다.

㉰ 최종제품의 비타민 B2의 함량이 2.0mg/100g이상이어야 한다.

㉱ 최종제품의 철의 함량이 10.0mg/100g이상이어야 한다.

② 클로렐라제품

㉮ 최종제품의 조단백질의 함량이 25.0%이상이어야 한다.

㉯ 최종제품의 엽록소의 함량이 500mg/100g이상이어야 한다.

㉰ 최종제품의 비타민 B2의 함량이 1.0mg/100g이상이어야 한다.

㉱ 최종제품의 철의 함량이 5.0mg/100g이상이어야 한다.

4) 규격

유 형 항 목	클로렐라원말	클로렐라제품
(1) 성상	고유의 색택을 가지고 이미‧이취가 없어야 한다.
(2) 조단백질(%)	표시량이상이어야 한다.
(3) 엽록소(mg/100g)	표시량이상이어야 한다.
(4) 비타민B2(mg/100g)	표시량이상이어야 한다.
(5) 철(mg/100g)	표시량이상이어야 한다.
(6) 엽록소 b	검출되어야 한다.
(7) 수분(%)	7.0이하	10.0이하 (단, 액상제품은 제외한다)
(8) 회분(%)	10.0이하	—
(9) 총페오포르바이드 (mg/100g)	80.0이하	40.0이하 (클로렐라원말의 양이 50.0%일 때 40.0이하이며, 원말의 배합량에 따라 환산 적용한다)
(10) 타르색소	검출되어서는 아니된다.
(11) 대장균군	음성이어야 한다.

6) 기능성내용

(1) 단백질 공급원

(2) 체질개선

(3) 영양보급

(4) 핵산 및 단백질, 엽록소, 섬유소등 성분 함유

(5) 건강증진 및 유지

Ⅸ. 기타

1. 버섯류

1) 적용범위

이 기준 및 규격은 버섯의 자실체 또는 균사체가 주원료이고 버섯의 자실체 또는 균사체의 섭취가 목적인 건강기능식품에 적용한다.

2) 건강기능식품유형의 정의

(1) 버섯자실체제품

영지버섯, 운지버섯, 표고버섯의 자실체의 건조물을 분말화한 것이나 자실체를 물 또는 주정으로 추출한 것을 주원료(건조분말 : 30.0%이상, 추출물 : 자실체의 건조물로 환산하여 제품 전체중량의 30.0%이상)로 하여 제조․가공한 것을 말한다.

(2) 버섯균사체제품

영지버섯, 운지버섯, 표고버섯의 균사체 배양물(균사체+배양액)을 물 또는 주정으로 추출한 것을 주원료(균사체 배양물의 건조물로 환산하여 제품 전체중량의 50.0%이상)로 하여 제조․가공한 것을 말한다.

3) 제조기준

(1) 자실체분말을 직접 식용으로 하는 경우 소화기내에서 유효성분의 용출이 용이하도록 미세하게 분말로 하여야 한다.

(2) 추출에 사용하는 주정은 농축과정에서 충분히 제거하여야 한다.

(3) 배양에 사용된 배지성분의 잔존량은 건조배양물의 10%이하이어야 한다.

4) 규격

(1) 성상 : 고유의 색택을 가지고 이미․이취가 없어야 한다.

(2) 자실체(%) : 표시량이상이어야 한다

(버섯자실체제품에 한하며, 추출물의 경우 자실체의 건조물로 환산).

(3) 균사체(%) : 표시량이상이어야 한다

(버섯균사체제품에 한하며, 추출물의 경우 균사체 배양물의 건조물로 환산).

(4) 확인시험 : 자실체 또는 균사체가 확인되어야 한다.

(5) 수분(%) : 7.0이하이어야 한다(단, 액상제품은 제외한다).

(6) 타르색소 : 검출되어서는 아니된다.

(7) 대장균군 : 음성이어야 한다.

5) 기능성내용

(1) 혈행을 원활히 하는데 도움

(2) 생리활성 물질 함유

(3) 건강증진 및 유지

2. 화분

1) 적용범위

이 기준 및 규격은 화분 또는 화분추출물이 주원료이고 화분 또는 화분추출물의 섭취가 목적인 건강기능식품에 적용한다.

2) 건강기능식품유형의 정의

(1) 화분

벌 또는 인공적으로 채취한 화분에서 이물을 제거하고 껍질을 파쇄한 것을 말한다.

(2) 화분추출물

화분을 기계적으로 껍질을 파쇄 또는 효소처리하여 추출한 것을 농축하거나 분말로 한 것을 말한다.

(3) 화분제품

화분을 주원료(30.0%이상)로 하여 제조․가공한 것을 말한다.

(4) 화분추출물제품

화분추출물을 주원료(고형분으로서 10.0%이상)로 하여 제조․가공한 것을 말한다.

3) 제조기준(기능성분 또는 지표성분의 함량)

(1) 화분

최종제품의 조단백질의 함량이 18.0%이상이어야 한다.

(2) 화분추출물

최종제품의 조단백질의 함량이 20.0%이상(건조물로서)이어야 한다.

(3) 화분제품

최종제품의 조단백질의 함량이 5.0%이상이어야 한다.

(4) 화분추출물제품

최종제품의 조단백질의 함량이 2.0%이상이어야 한다.

4) 규격

유 형 항 목	화분	화분추출물	화분제품, 화분추출물제품
(1) 성상	고유의 색택을 가지고 이미‧이취가 없어야 한다.
(2) 조단백질(%)	표시량이상이어야 한다.
(3) 수분(%)	8.0이하	8.0이하 (단, 액상제품은 제외한다)	10.0이하 (단, 액상제품은 제외한다)
(4) 타르색소	검출되어서는 아니된다.
(5) 대장균	음성이어야 한다.

5) 기능성내용

(1) 영양보급

(2) 피부건강에 도움

(3) 건강증진 및 유지

(4) 신진대사 기능

3. 프로폴리스추출물

1) 적용범위

이 기준 및 규격은 프로폴리스추출물이 주원료이고 프로폴리스추출물의 섭취가 목적인 건강기능식품에 적용한다.

2) 건강기능식품유형의 정의

(1) 프로폴리스추출물

꿀벌이 나무의 수액, 꽃의 암․수술에서 모은 화분과 꿀벌자신의 분비물을 이용하여 만든 프로폴리스에서 왁스를 제거하여 얻은 추출물, 이의 농축물 또는 건조물을 말한다.

(2) 프로폴리스추출물제품

프로폴리스추출물을 주원료로 하여 제조․가공한 것을 말한다.

3) 제조기준

(1) 추출용매는 물 또는 주정을 사용하여야 한다.

(2) 기능성분 또는 지표성분의 함량

① 프로폴리스추출물

최종제품의 총플라보노이드의 함량이 5.0%이상이어야 한다.(건고물로서)

② 프로폴리스추출물제품

최종제품의 총플라보노이드의 함량이 1.0%이상이어야 한다.

4) 규격

(1) 성상 : 고유의 색택과 향미를 가지며 이미․이취가 없다.

(2) 총플라보노이드(%) : 표시량이상이어야 한다.

(3) 확인시험(ρ-쿠마르산, 계피산, 플라보노이드) : 확인되어야 한다.

(4) 수분(%) : 10.0이하이어야 한다

(프로폴리스추출물에 한하며, 액상제품은 제외한다).

(5) 납(mg/kg) : 5.0이하이어야 한다.

(6) 디에틸렌글리콜 : 검출되어서는 아니된다.

(7) 대장균군 : 음성이어야 한다.

6) 기능성내용

(1) 항균작용

(2) 항산화작용

제5장 검체의 채취 및 취급

1. 검체의 채취 및 취급의 의의

건강기능식품에 관한 법률 제20조에 따라서 관계공무원이 검사대상으로부터 일부의 검체를 채취한 후, 기준‧규격의 적부, 오염물질 등에 대한 안전성 검사의 결과에 따라 행정조치 등이 이루어지게 되므로 검사대상의 선정, 검체의 채취‧취급‧운반 등은 효율성을 확보하면서 과학적인 방법으로 수행하여야 한다. 따라서 검체를 채취하여 건강기능식품검사기관에 검사 의뢰하는 것은 중요한 의의를 가지므로 관계공무원은 검체채취 및 취급방법 등에 대하여 충분한 지식을 가지고 그 직무를 수행하여야 한다.

2. 용어의 정의

1) 검    체∶검사대상으로부터 채취된 시료를 말한다.

2) 검체단위∶검체를 구성한 단위로서 한 번에 채취되는 건강기능식품의 양을 말한다.

3) 검사대상∶동일조건에서 생산‧제조‧가공․포장된 건강기능식품으로 검체가 채취되는 하나의 대상을 말한다.

3. 검체채취의 일반원칙

1) 검체의 채취는 건강기능식품에 관한 법률 제20조 및 같은법 시행규칙 제22조에서 규정하는 자가 수행하여야 한다.

2) 검체는 검사목적, 검사항목 등을 참작하여 검사대상 전체를 대표할 수 있는 최소한도의 양을 채취하여야 한다.

3) 일반적으로 검체는 제조번호, 제조연월일, 유통기한이 동일한 것을 검사대상으로 하나, 품종, 건강기능식품유형, 제조회사, 기호, 수출국, 수출연월일, 도착연월일, 적재선, 수송차량, 화차, 포장형태 및 외관 등의 상태를 잘 파악하여 그 건강기능식품의 특성 및 검사목적을 고려하여 채취하도록 하여야 한다.

4) 채취된 검체가 손상되지 않도록 주의하여야 하고, 건강기능식품을 포장하기 전 또는 포장된 것을 개봉하여 검체로 채취하는 경우에는 이물질의 혼입, 미생물의 오염 등이 되지 않도록 주의하여야 한다.

5) 채취한 검체는 봉인하여야 하며 봉인을 파손하지 않고는 봉인을 열 수 없도록 하여야 한다.

4. 검체의 채취 및 취급요령

검체채취 시에는 검사 목적, 대상 건강기능식품의 종류와 물량, 오염 가능성, 균질 여부 등 검체의 물리‧화학‧생물학적 상태를 고려하여야 한다.

1) 검체의 채취 요령

(1) 검사대상 건강기능식품이 불균질 할 때

① 검체가 불균질 할 때에는 일반적으로 다량의 검체가 필요하나 검사의 효율성, 경제성 등으로 부득이 소량의 검체를 채취할 수 밖에 없는 경우에는 외관, 보관상태 등을 종합적으로 판단하여 의심스러운 것을 대상으로 검체를 채취할 수 있다.

② 특성상 침전․부유 등으로 균질하지 않은 제품은 전체를 가능한 한 균일하게 처리한 후 대표성이 있도록 채취하여야 한다.

(2) 검사항목에 따른 균질 여부 판단

검체의 균질 여부는 검사항목에 따라 달라질 수 있다. 어떤 검사대상 건강기능식품이 불균질 하더라도 이에 함유된 중금속 등의 성분은 균질한 것으로 보아 검체를 채취할 수 있다.

(3) 포장된 검체의 채취

① 깡통, 병, 상자 등 용기‧포장에 넣어 유통되는 건강기능식품은 가능한 한 개봉하지 않고 그대로 채취한다.

② 대형 용기‧포장에 넣은 건강기능식품은 검사대상 전체를 대표할 수 있는 일부를 채취 할 수 있다.

(4) 냉장, 냉동 검체의 채취

냉장 또는 냉동 건강기능식품을 검체로 채취하는 경우에는 그 상태를 유지하면서 채취하여야 한다.

(5) 미생물 검사를 요하는 검체의 채취

① 검체를 채취‧운송‧보관하는 때에는 채취당시의 상태를 유지할 수 있도록 밀봉되는 용기‧포장 등을 사용하여야 한다.

② 검체를 소분 채취할 경우에는 멸균된 기구‧용기 등을 사용하여 무균적으로 행하여야 한다.

③ 검체는 부득이한 경우를 제외하고는 정상적인 방법으로 보관‧유통 중에 있는 것을 채취하여야 한다.

④ 검체는 관련정보 및 특별수거계획에 의한 경우를 제외하고는 완전 포장된 것에서 채취하여야 한다.

(6) 기체를 발생하는 검체의 채취

① 검체가 상온에서 쉽게 기체를 발산하여 검사결과에 영향을 미치는 경우는 포장을 개봉하지 않고 하나의 포장을 그대로 검체단위로 채취하여야 한다.

② 다만, 소분 채취하여야 하는 경우에는 가능한 한 채취된 검체를 즉시 밀봉․냉각시키는 등 검사결과에 영향을 미치지 않는 방법으로 채취하여야 한다.

(7) 페이스트상 또는 시럽상 건강기능식품

① 검체의 점도가 높아 채취하기 어려운 경우에는 검사결과에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 가온 등 적절한 방법으로 점도를 낮추어 채취할 수 있다.

② 검체의 점도가 높고 불균질하여 일상적인 방법으로 균질하게 만들 수 없을 경우에는 검사결과에 영향을 주지 아니하는 방법으로 균질하게 처리할 수 있는 기구 등을 이용하여 처리한 후 검체를 채취할 수 있다.

(8) 검사 항목에 따른 검체채취 주의점

① 수분

증발 또는 흡습 등에 의한 수분 함량 변화를 방지하기 위하여 검체를 밀봉 용기에 넣고 가능한 한 온도 변화를 최소화하여야 한다.

② 산가 또는 과산화물가

빛 또는 온도 등에 의한 지방 산화의 촉진을 방지하기 위하여 검체를 빛이 차단되는 밀폐 용기에 넣고 채취 용기내의 공간 체적과 온도 변화를 가능한 한 최소화하여야 한다.

2) 검체채취내역서의 기재

관계공무원은 검체채취 시 당해 검체와 함께 검체채취 내역서를 첨부하여야 한다. 다만, 검체채취 내역서를 생략하여도 기준‧규격검사에 지장이 없다고 인정되는 때에는 그러하지 아니할 수 있다.

3) 검체의 운반 요령

(1) 채취된 검체는 오염, 파손, 손상, 해동, 변형 등이 되지 않도록 주의하여 검사실로 운반하여야 한다.

(2) 검체가 장거리로 운송되거나 대중교통으로 운송되는 경우에는 손상되지 않도록 특히 주의하여 포장한다.

(3) 냉동 검체의 운반

① 냉동 검체는 냉동 상태에서 운반하여야 한다.

② 냉동 장비를 이용할 수 없는 경우에는 드라이아이스 등으로 냉동상태를 유지하여 운반할 수 있다.

(4) 냉장 검체의 운반

냉장 검체는 온도를 유지하면서 운반하여야 한다. 얼음 등을 사용하여 냉장온도를 유지하는 때에는 얼음 녹은 물이 검체에 오염되지 않도록 주의하여야 하며 드라이아이스 사용 시 검체가 냉동되지 않도록 주의하여야 한다.

(5) 미생물 검사용 검체의 운반

① 부패‧변질 우려가 있는 검체

미생물학적인 검사를 요하는 검체는 멸균용기에 무균적으로 채취하여 당해 건강기능식품의 냉장보관 온도를 유지하면서 조속히(4시간 이내) 검사기관에 운반하여야 한다. 부득이한 사정으로 냉장온도를 유지할 수 없거나 조속히 운반하지 못하였을 때에는 재수거하거나 채취일시 및 그 상태를 기록하여 검사기관에 검사 의뢰한다.

② 부패‧변질의 우려가 없는 검체

미생물 검사용 검체일지라도 운반과정 중 부패‧변질우려가 없는 검체는 반드시 냉장온도에서 운반할 필요는 없으나 오염, 검체 및 포장의 파손 등에 주의하여야 한다.

③ 얼음 등을 사용할 때의 주의사항

얼음 등을 사용할 때에는 얼음 녹은 물이 검체에 오염되지 않도록 주의하여야 한다.

(6) 기체를 발생하는 검체의 운반

소분 채취한 검체의 경우에는 적절하게 냉장 또는 냉동한 상태로 운반하여야 한다.

5. 검체채취 기구 및 용기

1) 검체채취 기구 및 용기는 검체의 종류, 형상, 용기‧포장 등이 다양하므로 검체의 수거 목적에 적절한 기구 및 용기를 준비하여야 한다.

2) 식품공전 제6. 기구 및 용기․포장의 기준․규격에 적합한 것이어야 한다.

3) 기구 및 용기는 운반, 세척, 멸균에 편리한 것이어야 하며 미생물 검사를 위한 검체 채취의 기구‧용기 중 검체와 직접 접촉하는 부분은 반드시 멸균 처리하여야 한다.

4) 검체와 직접 접촉하는 기구 및 용기는 검사결과에 영향을 미치지 않는 것이어야 한다.

5) 검체채취 및 기구‧용기의 종류

(1) 채취용 기구

핀셋, 가위, 칼, 캔 따개, 나무망치, 전기톱 또는 톱, 곡물검체채취기, 드라이어, 피펫, 커터, 액체검체채취용 펌프 또는 튜브, 국자, 깔때기 등

(2) 채취용 용기‧포장

검체봉투(대, 중, 소), 검체 채취병(광구병) 등

(3) 소독용구

알코올램프, 알코올, 솜 등

(4) 기  타

테이프, 아이스박스, 사진기, 필기구 등

제6장 부  표

1. 영양소기준치

영양소	기준치	영양소	기준치	영양소	기준치
탄수화물(g)	328	철분(㎎)	15	판토텐산(㎎)	5
식이섬유(g)	25	비타민D(㎍)	5	인(㎎)	700
단백질(g)	60	비타민E(㎎α-TE)	10	요오드(㎍)	75
지방(g)	50	비타민K(㎍)	55	마그네슘(㎎)	220
포화지방(g)	15	비타민B1(㎎)	1.0	아연(㎎)	12
콜레스테롤(㎎)	300	비타민B2(㎎)	1.2	셀렌(㎍)	50
나트륨(㎎)	2,000	나이아신(㎎ NE)	13	구리(㎎)	1.5
칼륨(㎎)	3,500	비타민B6(㎎)	1.5	망간(㎎)	2.0
비타민A(㎍ RE)	700	엽산(㎍)	250	크롬(㎍)	50
비타민C(㎎)	100	비타민B12(㎍)	1.0	몰리브덴(㎍)	25
칼슘(㎎)	700	비오틴(㎍)	30

- VitA, VitD, VitE는 기준지표에 따른 단위로 표시하되 괄호를 하여 IU단위로 표시할 수 있다.

2. 한국인 영양섭취기준(KDRIs, Dietary Refenence Intakes for Koreans)

출처 : 한국영양학회, 한국인영양섭취기준위원회, 2005

1) 다량영양소

성별	연령	신장(cm)	체중(kg)	에너지(kcal/일)				탄수화물(g/일)				지방(g/일)				n-6 불포화지방산(g/일)
				필요 추정량	권장 섭취량	충분 섭취량	상한 섭취량	평균 필요량	권장 섭취량	충분 섭취량	상한 섭취량	평균 필요량	권장 섭취량	충분 섭취량	상한 섭취량	평균 필요량	권장 섭취량	충분 섭취량	상한 섭취량
영아	0~5(개월)	61.9	6.5	600						55				25				2.0
	6~11	72.3	9.1	730						90				25				4.5
유아	1~2(세)	85.9	12.2	1,000
	3~5	102	16.3	1,400
남자	6~8(세)	122	23.8	1,600
	9~11	138	34.5	1,900
	12~14	159	49.6	2,400
	15~19	172	63.8	2,700
	20~29	173	65.8	2,600
	30~49	170	63.6	2,400
	50~64	166	60.6	2,200
	65~74	164	59.2	2,000
	75이상	164	59.2	2,000
여자	6~8(세)	120	22.9	1,500
	9~11	138	32.6	1,700
	12~14	155	46.5	2,000
	15~19	160	53.0	2,000
	20~29	160	56.3	2,100
	30~49	157	54.2	1,900
	50~64	154	52.2	1,800
	65~74	151	50.2	1,600
	75이상	151	50.2	1,600
임신부		-	-	+0/340/450*														9
수유부		-	-	+320														10

성별	연령	n-3 불포화지방산(g/일)				단백질(g/일)				식이섬유(g/일)				수분(㎖/일)
		평균 필요량	권장 섭취량	충분 섭취량	상한 섭취량	평균 필요량	권장 섭취량	충분 섭취량	상한 섭취량	평균 필요량	권장 섭취량	충분 섭취량	상한 섭취량	평균 필요량	권장 섭취량	충분 섭취량	상한 섭취량
영아	0~5(개월)			0.3				9.5								700
	6~11			0.8		10	13.5									800
유아	1~2(세)					12	15					12				1,100
	3~5					15	20					17				1,400
남자	6~8(세)					20	25					19				1,700
	9~11					30	35					23				2,000
	12~14					40	50					29				2,400
	15~19					45	60					32				2,700
	20~29					45	55					31				2,700
	30~49					45	55					29				2,500
	50~64					40	50					26				2,300
	65~74					40	50					26				2,100
	75이상					40	50					26				2,100
여자	6~8(세)					20	25					18				1,600
	9~11					25	35					20				1,800
	12~14					35	45					24				2,000
	15~19					35	45					24				2,100
	20~29					35	45					25				2,100
	30~49					35	45					23				2,000
	50~64					35	45					22				1,800
	65~74					35	45					22				1,700
	75이상					35	45					22				1,700
임신부				2.1		+19	+25					+5				+200
수유부				2.4		+20	+25					+4				+700

*임신 3분기별 영양섭취기준

2) 지용성비타민

성별	연령	비타민 A(㎍ RE/일)				비타민 D(㎍/일)				비타민 E(mg α-TE/일)				비타민 K(㎍/일)
		평균 필요량	권장 섭취량	충분 섭취량	상한 섭취량	평균 필요량	권장 섭취량	충분 섭취량	상한 섭취량	평균 필요량	권장 섭취량	충분 섭취량	*상한 섭취량	평균 필요량	권장 섭취량	충분 섭취량	상한 섭취량
영아	0~5(개월)			350	600			5	25			3				4
	6~11			400	600			5	25			4				7
유아	1~2(세)	200	300		600			10	60			5	100			25
	3~5	210	300		700			10	60			6	130			30
남자	6~8(세)	290	400		1,000			10	60			7	180			45
	9~11	380	550		1,400			10	60			9	260			55
	12~14	500	700		2,100			10	60			10	380			70
	15~19	600	850		2,400			10	60			10	430			80
	20~29	540	750		3,000			5	60			10	540			75
	30~49	520	750		3,000			5	60			10	540			75
	50~64	500	700		3,000			10	60			10	540			75
	65~74	500	700		3,000			10	60			10	540			75
	75이상	500	700		3,000			10	60			10	540			75
여자	6~8(세)	270	400		1,000			10	60			7	180			45
	9~11	350	500		1,400			10	60			9	260			55
	12~14	460	650		2,100			10	60			10	380			65
	15~19	500	700		2,400			10	60			10	430			65
	20~29	460	650		3,000			5	60			10	540			65
	30~49	450	650		3,000			5	60			10	540			65
	50~64	430	600		3,000			10	60			10	540			65
	65~74	430	600		3,000			10	60			10	540			65
	75이상	430	600		3,000			10	60			10	540			65
임신부		+50	+70		3,000			+5	60			+0	540			+0
수유부		+350	+500		3,000			+5	60			+3	540			+0

*RRR-α-tocopherol

3) 수용성비타민

성별	연령	비타민 C(mg/일)				티아민(mg/일)				리보플라빈(mg/일)				니아신(mg NE/일)
		평균 필요량	권장 섭취량	충분 섭취량	상한 섭취량	평균 필요량	권장 섭취량	충분 섭취량	상한 섭취량	평균 필요량	권장 섭취량	충분 섭취량	상한 섭취량	평균 필요량	권장 섭취량	충분 섭취량	1)	2)
영아	0~5(개월)			35				0.2				0.3				2
	6~11			45				0.3				0.4				3
유아	1~2(세)	30	40		350	0.4	0.5			0.5	0.6			5	6		10	180
	3~5	30	40		500	0.4	0.5			0.6	0.7			5	7		10	250
남자	6~8(세)	40	60		700	0.6	0.7			0.7	0.9			7	9		15	350
	9~11	55	70		1,000	0.8	0.9			0.9	1.1			9	12		20	500
	12~14	75	100		1,400	1.0	1.2			1.3	1.5			12	15		25	700
	15~19	85	110		1,600	1.1	1.4			1.5	1.8			13	18		30	800
	20~29	75	100		2,000	1.0	1.2			1.3	1.5			12	16		35	1,000
	30~49	75	100		2,000	1.0	1.2			1.3	1.5			12	16		35	1,000
	50~64	75	100		2,000	1.0	1.2			1.3	1.5			12	16		35	1,000
	65~74	75	100		2,000	1.0	1.2			1.3	1.5			12	16		35	1,000
	75이상	75	100		2,000	1.0	1.2			1.3	1.5			12	16		35	1,000
여자	6~8(세)	40	60		700	0.5	0.6			0.6	0.7			6	9		15	350
	9~11	55	70		1,000	0.7	0.8			0.8	0.9			8	10		20	500
	12~14	70	90		1,400	0.8	1.0			1.0	1.2			10	13		25	700
	15~19	75	100		1,600	0.8	1.0			1.0	1.2			10	13		30	800
	20~29	75	100		2,000	0.9	1.1			1.0	1.2			11	14		35	1,000
	30~49	75	100		2,000	0.9	1.1			1.0	1.2			11	14		35	1,000
	50~64	75	100		2,000	0.9	1.1			1.0	1.2			11	14		35	1,000
	65~74	75	100		2,000	0.9	1.1			1.0	1.2			11	14		35	1,000
	75이상	75	100		2,000	0.9	1.1			1.0	1.2			11	14		35	1,000
임신부		+10	+10		2,000	+0.4	+0.5			+0.3	+0.4			+3	+4		35	1,000
수유부		+35	+35		2,000	+0.3	+0.4			+0.4	+0.5			+3	+4		35	1,000

1) 상한섭취량 1: 니코틴산(mg/일)

2) 상한섭취량 2: 니코틴아미드(mg/일)

비타민 B6(mg/일)				엽산(㎍ DFE/일)				비타민 B12(㎍/일)				판토텐산(mg/일)				비오틴(㎍/일)
평균 필요량	권장 섭취량	충분 섭취량	상한 섭취량	평균 필요량	권장 섭취량	충분 섭취량	상한 섭취량	평균 필요량	권장 섭취량	충분 섭취량	상한 섭취량	평균 필요량	권장 섭취량	충분 섭취량	상한 섭취량	평균 필요량	권장 섭취량	충분 섭취량	상한 섭취량
		0.1				65				0.2				1.7				5
		0.3				80				0.5				1.8				6
0.5	0.6		25	120	150		300	0.75	0.9					2				8
0.6	0.7		35	150	180		300	0.9	1.1					2				10
0.7	0.9		45	180	220		400	1.1	1.3					3				15
0.9	1.1		60	250	300		600	1.5	1.8					4				20
1.3	1.5		80	300	360		800	1.8	2.2					5				25
1.5	1.8		100	320	400		1,000	2.0	2.4					6				25
1.3	1.5		100	320	400		1,000	2.0	2.4					5				30
1.3	1.5		100	320	400		1,000	2.0	2.4					5				30
1.3	1.5		100	320	400		1,000	2.0	2.4					5				30
1.3	1.5		100	320	400		1,000	2.0	2.4					5				30
1.3	1.5		100	320	400		1,000	2.0	2.4					5				30
0.7	0.8		45	180	220		400	1.1	1.3					3				15
0.9	1.0		60	250	300		600	1.5	1.8					4				20
1.2	1.4		80	300	360		800	1.8	2.2					5				25
1.2	1.4		100	320	400		1,000	2.0	2.4					6				25
1.2	1.4		100	320	400		1,000	2.0	2.4					5				30
1.2	1.4		100	320	400		1,000	2.0	2.4					5				30
1.2	1.4		100	320	400		1,000	2.0	2.4					5				30
1.2	1.4		100	320	400		1,000	2.0	2.4					5				30
1.2	1.4		100	320	400		1,000	2.0	2.4					5				30
+0.7	+0.8		100	+200	+200		1,000	+0.2	+0.2					+1				+0
+0.6	+0.7		100	+130	+150		1,000	+0.2	+0.2					+2				+5

4) 다량무기질

성별	연령	칼슘(mg/일)				인(mg/일)				나트륨(g/일)
		평균 필요량	권장 섭취량	충분 섭취량	상한 섭취량	평균 필요량	권장 섭취량	충분 섭취량	상한 섭취량	평균 필요량	권장 섭취량	충분 섭취량	상한 섭취량	목표량
영아	0~5(개월)			200				100				0.12
	6~11			300				300				0.37
유아	1~2(세)	300	500		2,500	350	500		3,000			0.8	100
	3~5	400	600		2,500	390	500		3,000			1.0	130
남자	6~8(세)	550	700		2,500	550	700		3,000			1.2	180
	9~11	550	800		2,500	810	1,000		3,500			1.5	260	2.0
	12~14	800	1,000		2,500	870	1,000		3,500			1.5	380	2.0
	15~19	800	1,000		2,500	790	1,000		3,500			1.5	430	2.0
	20~29	580	700		2,500	580	700		3,500			1.5	540	2.0
	30~49	580	700		2,500	580	700		3,500			1.5	540	2.0
	50~64	580	700		2,500	580	700		3,500			1.3	540	2.0
	65~74	580	700		2,500	580	700		3,500			1.2	540	2.0
	75이상	580	700		2,500	580	700		3,000			1.1	540	2.0
여자	6~8(세)	550	700		2,500	450	600		3,000			1.2	180	2.0
	9~11	550	800		2,500	700	900		3,500			1.5	260	2.0
	12~14	750	900		2,500	690	900		3,500			1.5	380	2.0
	15~19	750	900		2,500	590	800		3,500			1.5	430	2.0
	20~29	580	700		2,500	580	700		3,500			1.5	540	2.0
	30~49	580	700		2,500	580	700		3,500			1.5	540	2.0
	50~64	580	800		2,500	580	700		3,500			1.3	540	2.0
	65~74	580	800		2,500	580	700		3,500			1.2	540	2.0
	75이상	580	800		2,500	580	700		3,000			1.1	540	2.0
임신부		+220	+300		2,500	+0	+0		3,000			+0	540	2.0
수유부		+300	+400		2,500	+0	+0		3,500			+0	540	2.0

성별	연령	염소(g/일)				칼륨(g/일)				마그네슘(mg/일)
		평균 필요량	권장 섭취량	충분 섭취량	상한 섭취량	평균 필요량	권장 섭취량	충분 섭취량	상한 섭취량	평균 필요량	권장 섭취량	충분 섭취량	*상한 섭취량
영아	0~5(개월)			0.18				0.4				30
	6~11			0.56				0.7				55
유아	1~2(세)			1.2				2.5		60	75		(65)
	3~5			1.5				3.0		80	100		(85)
남자	6~8(세)			1.9				3.8		120	140		(120)
	9~11			2.3				4.7		170	200		(170)
	12~14			2.3				4.7		250	300		(250)
	15~19			2.3				4.7		340	400		(350)
	20~29			2.3				4.7		285	340		(350)
	30~49			2.3				4.7		295	350		(350)
	50~64			2.0				4.7		295	350		(350)
	65~74			1.8				4.7		295	350		(350)
	75이상			1.6				4.7		295	350		(350)
여자	6~8(세)			1.9				3.8		115	140		(120)
	9~11			2.3				4.7		165	200		(170)
	12~14			2.3				4.7		230	280		(250)
	15~19			2.3				4.7		280	340		(350)
	20~29			2.3				4.7		235	280		(350)
	30~49			2.3				4.7		235	280		(350)
	50~64			2.0				4.7		235	280		(350)
	65~74			1.8				4.7		235	280		(350)
	75이상			1.6				4.7		235	280		(350)
임신부				+0				+0		+33	+40		(350)
수유부				+0				+0.4		+0	+0		(350)

*식품외 급원의 마그네슘에만 해당

5) 미량무기질

성별	연령	철(mg/일)				아연(mg/일)				구리(㎍/일)				불소(mg/일)
		평균 필요량	권장 섭취량	충분 섭취량	상한 섭취량	평균 필요량	권장 섭취량	충분 섭취량	상한 섭취량	평균 필요량	권장 섭취량	충분 섭취량	상한 섭취량	평균 필요량	권장 섭취량	충분 섭취량	상한 섭취량
영아	0~5(개월)			0.26	40			1.73				225				0.01	0.6
	6~11	5	7		40	2.2	2.5					290				0.5	0.9
유아	1~2(세)	5	7		40	2.4	3		6	230	300		2,000			0.6	1.2
	3~5	5	7		40	3.1	4		8	290	380		2,000			0.8	1.6
남자	6~8(세)	7	9		40	4.3	5		13	340	440		3,000			1.0	2.2
	9~11	9	12		40	6.2	7		18	440	570		5,000			2.0	10
	12~14	9	12		40	6.5	8		26	580	750		7,000			2.5	10
	15~19	12	16		45	8.4	10		34	670	870		10,000			3.0	10
	20~29	8	10		45	8.1	10		35	600	800		10,000			3.5	10
	30~49	8	10		45	7.9	9		35	600	800		10,000			3.5	10
	50~64	8	10		45	7.5	9		35	600	800		10,000			3.0	10
	65~74	8	10		45	7.2	9		35	600	800		10,000			3.0	10
	75이상	8	10		45	6.9	8		35	600	800		10,000			3.0	10
여자	6~8(세)	7	9		40	4.1	5		13	340	440		3,000			1.0	2.2
	9~11	9	12		40	5.9	7		18	440	570		5,000			2.0	10
	12~14	9	12		40	6.1	7		26	580	750		7,000			2.5	10
	15~19	12	16		45	7.2	9		34	670	870		10,000			2.5	10
	20~29	11	14		45	7.0	8		35	600	800		10,000			3.0	10
	30~49	11	14		45	6.8	8		35	600	800		10,000			2.5	10
	50~64	7	9		45	6.3	8		35	600	800		10,000			2.5	10
	65~74	7	9		45	6.0	7		35	600	800		10,000			2.5	10
	75이상	7	9		45	5.8	7		35	600	800		10,000			2.5	10
임신부		+7.5	+10		45	+2.0	+2.5		35	+100	+130		10,000			+0	10
수유부		+0	+0		45	+4.3	+5.0		35	+350	+450		10,000			+0	10

성별	연령	망간(mg/일)				요오드(㎍/일)				셀레늄(㎍/일)				몰리브덴(㎍/일)
		평균 필요량	권장 섭취량	충분 섭취량	상한 섭취량	평균 필요량	권장 섭취량	충분 섭취량	상한 섭취량	평균 필요량	권장 섭취량	충분 섭취량	상한 섭취량	평균 필요량	권장 섭취량	충분 섭취량	상한 섭취량
영아	0~5(개월)			0.008				130				8.5	45
	6~11			0.8				170				11	60
유아	1~2(세)			1.2	2	55	80			16	20		85				100
	3~5			2.0	3	65	90			18	25		100				150
남자	6~8(세)			2.5	4	75	100			24	30		150				200
	9~11			3.0	5	85	120			32	40		200				300
	12~14			3.3	7	90	130			41	50		250				400
	15~19			3.5	9	95	140			47	60		300				500
	20~29			3.5	11	95	150		3,000	42	50		400				600
	30~49			3.5	11	95	150		3,000	42	50		400				600
	50~64			3.5	11	95	150		3,000	42	50		400				600
	65~74			3.5	11	95	150		3,000	42	50		400				600
	75이상			3.5	11	95	150		3,000	42	50		400				600
여자	6~8(세)			2.3	4	75	100			24	30		150				200
	9~11			2.5	5	85	120			32	40		200				300
	12~14			2.8	7	90	130			41	50		250				400
	15~19			3.0	9	95	140			47	60		300				500
	20~29			3.0	11	95	150		3,000	42	50		400				600
	30~49			3.0	11	95	150		3,000	42	50		400				600
	50~64			3.0	11	95	150		3,000	42	50		400				600
	65~74			3.0	11	95	150		3,000	42	50		400				600
	75이상			3.0	11	95	150		3,000	42	50		400				600
임신부				+0	11	+65	+90			+3	+4		400				600
수유부				+0	11	+130	+180			+9	+11		400				600

Ⅱ. 건강기능식품 시험법

목 차

제1장 총칙
제2장 일반시험법
	1. 일반성분시험법
		1) 수분
		2) 회분
		3) 질소화합물
		4) 지질
		5) 탄수화물
		6) 열량의 계산
	2. 보존료 시험법
		1) 데히드로초산, 소르빈산, 안식향산, 파라옥시안식향산 및 그 염류
		2) 프로피온산 및 그 염류
		3) 소르빈산, 안식향산 및 그 염류
	3. 산화방지제 시험법
		1) 부틸히드록시아니졸(BHA), 디부틸히드록시톨루엔(BHT)
		2) 몰식자산프로필
		3) 이디티에이이나트륨, 이디티에이칼슘나트륨
		4) 부틸히드록시아니질, 디부틸히드록시톨루엔, 터셔리부틸히드로퀴논 및 몰식자산프로필
	4. 착색료 시험법
		1) 타르색소
		2) 유용성색소

	5. 유해성 금속시험법
		1) 시험용액의 조제
		2) 측정
		3) 금속별 시험
	6. 이물시험법
		1) 체분별법
		2) 여과법
		3) 와일드만 라스크법
		4) 침강법
	7. 미생물 시험법
		1) 일반사항
		2) 세균수
		3) 저온세균수
		4) 내열성세균수
		5) 대장균군
		6) 대장균
		7) 총균수
		8) 유산균수
		9) 진균수(효모 및 사상균수)
		10) 탄저균
		11) 결핵균
		12) 브루셀라
		13) 살모넬라
		14) 황색포도상구균
		15) 장염비브리오
		16) 세균(세균발육시험) 등 병조림제품, 레트로트제품
		17) 클로스트리디움 퍼프린센스
		18) 리스테리아 모노사이토제네스
		19) 대장균 O157:H7
		20) 여시니아 엔테로콜리티카
		21) 바실러스 세레우스
		22) 캠필로박터 제주니
		23) 클로스트리디움 보툴리움

	8. 인삼․홍삼제품 중 농약잔류시험법
	9. 붕해시험법
		1) 장치
		2) 시험액
		3) 조작법
	10. 미량성분시험법
		1) 무기질류
		2) 비타민류
	11. 방사능 잠정허용기준 시험법
		1) 전처리 방법
		2) 방사능 핵종시험
		3) 방사능 시험
	12. 내용량 시험법
		1) 용량표시제품
		2) 중량표시제품
		3) 소포장제품
		4) 캅셀제품
		5) 통조림제품
	13. 진공도시험법
	14. 입도시험법(과립제품)
	15	기타시험법

제3장 건강기능식품별 시험법
	Ⅰ. 단백질류
		1. 단백질
		2. 대두단백
		3. 로얄젤리
		4. 아미노산류
		5. 자라분말
	Ⅱ. 지질류
		1. 감마리놀레산
		2. 레시틴
		3. 배아유
		4. 뱀장어유
		5. 식물스테롤/식물스테롤에스테르
		6. 스쿠알렌
		7. 알콕시글리세롤
		8. 옥타코사놀
		9. 에이코사펜타엔산(EPA)/도코사헥사엔산(DHA)
		10. 자라유
		11. 지방산류
		12. 포도씨유
	Ⅲ. 탄수화물류
		1. 글로코사민
		2. 뮤코다당․단백
		3. 식이섬유
		4. 키토올리고당
		5. 키토산
		6. 프락토올리고당
	Ⅳ. 비타민류 및 무기질류
		1. 베타카로틴
		2. 비타민류
		3. 무기질류

	Ⅴ. 식물류
		1. 녹차추출물
		2. 매실추출물
		3. 배아
		4. 알로에
		5. 인삼
		6. 엽록소
		7. 홍삼
	Ⅵ. 발효미생물류
		1. 식물추출발효
		2. 프로바이오틱스
		3. 홍국
		4. 효모
		5. 효소
	Ⅶ. 조류
		1. 스피루니나
		2. 클로렐라
	Ⅷ. 기타
		1. 버섯류
		2. 화분
		3. 프로폴리스추출물
제4장 시약․시액․표준용액 및 용량분석용 규정용액
제5장 부표

제1장 총칙

1. 용어의 정의 및 단위

1) “A ～ B”는 A이상 B이하를 뜻한다.

2) “건조물(고형물)”은 건조하여 남은 것으로서 별도의 규격이 정하여져 있지 않는 한 수분함량이 15.0% 이하인 것을 말한다.

3) 이 공전에서 계량의 단위는 다음의 기호를 사용한다.

(1) 길이∶m, ㎝, ㎜, ㎛, ㎚

(2) 용량∶ℓ, ㎖, ㎕

(3) 질량∶㎏, g, ㎎, ㎍, ng, pg

(4) 넓이∶㎠, ㎡, ㎟

(5) 열량∶kcal, kj

(6) 온도 : ℃

4) 원자량은 최신 국제원자량표에 의하고, 분자량은 국제원자량표에 의하여 계산한다.

5) 질량백분율을 표시할 때에는 %의 기호를 쓰며, 용액 100㎖중의 물질함량(g)을 표시할 때에는 w/v%로, 용액 100㎖중의 물질함량(㎖)을 표시할 때에는 v/v%의 기호를 쓴다. 질량백만분율을 표시할 때에는 ㎎/㎏을 사용하며, ㎎/ℓ도 사용할 수 있다.

6) 표준온도는 20℃   , 상온은 15～25℃   , 실온은 1～35℃   , 미온은 30～40℃  로 한다.

7) 따로 규정이 없는 한 찬물은 15℃  이하, 온탕은 60～70℃  , 열탕은 약 100℃  의 물로 하며 “수욕상 또는 수욕 중에서 가열 한다”라 함은 따로 규정이 없는 한 그 가열온도를 약 100℃  로 하되, 수욕대신 약 100℃  의 증기욕을 쓸 수 있다.

8) “찬 곳(냉소)”이라 함은 따로 규정이 없는 한 0～15℃  의 장소를 말한다.

9) 시험은 따로 규정이 없는 한 상온에서 실시하고 조작 후 30초 이내에 관찰한다. 다만, 온도의 영향이 있는 것에 대하여는 표준온도에서 행한다.

10) 시험에 쓰는 물은 따로 규정이 없는 한 증류수 또는 정제수로 한다.

11) 용액이라 기재하고 그 용매를 표시하지 아니하는 것은 수용액을 말한다.

12) 액성을 산성, 알카리성 또는 중성으로 표시한 것은 따로 규정이 없는 한 pH미터기 또는 리트머스지를 써서 시험한다. 액성을 상세히 나타낼 때에는 pH값을 쓴다. 또한, 강산성은 pH 약 3.0이하, 약산성은 pH 약 3.0～5.0, 미산성은 pH 약 5.0～6.5, 중성은 pH 약 6.5～7.5, 미알카리성은 pH 약 7.5～9.0, 약알카리성은 pH 약 9.0～11.0, 강알카리성은 pH 약 11.0이상을 말한다.

13) 용액의 농도를 (1→5), (1→10), (1→100) 등으로 나타낸 것은 고체시약 1g 또는 액체시약 1㎖를 용매에 녹여 전량을 각각 5㎖, 10㎖, 100㎖등으로 하는 것을 뜻한다. 또한 (1＋1), (1＋5)등으로 기재한 것은 고체시약 1g 또는 액체시약 1㎖에 용매 1㎖ 또는 5㎖를 혼합하는 비율을 나타낸다. 용매는 따로 표시되어 있지 않으면 물을 써서 희석한다.

14) 혼액을 (1∶1), (4∶2∶1) 등으로 나타낸 것은 액체시약의 혼합 용량비 또는 고체시약의 혼합 무게비를 말한다.

15) 무게를 “정밀히 단다”라 함은 달아야 할 최소단위를 고려하여 0.1㎎, 0.01㎎ 또는 0.001㎎까지 다는 것을 말한다. 또 무게를 “정확히 단다”라 함은 규정된 수치의 무게를 그 자리수까지 다는 것을 말한다.

16) 검체를 취하는 양에 “약”이라고 한 것은 따로 규정이 없는 한 기재량의 90～110%의 범위 내에서 취하는 것을 말한다.

17) 건조 혹은 강열할 때 “항량”이라고 기재한 것은 다시 계속하여 1시간 더 건조 혹은 강열할 때에 전후의 칭량차가 전회 측정한 무게의 0.1%이하임을 말한다. 다만, 칭량차가 화학천칭을 썼을 때 0.5㎎이하, 마이크로 화학천칭을 썼을 때 0.01㎎이하인 경우에는 항량으로 본다.

18) 데시케이터의 건조제는 따로 규정이 없는 한 실리카겔로 한다.

19) 감압은 따로 규정이 없는 한 15㎜Hg이하로 한다.

20) 방울수(滴水)를 측정할 때에는 20℃  에서 증류수 20방울을 적하할 때 그 무게가 0.90～1.10g이 되는 기구를 쓴다.

21) “초임계추출”이라 함은 임계온도와 임계압력이상의 상태에 있는 유체를 이용하여 추출하는 것을 말한다.

제2장 일반시험법

1. 일반성분시험법

일반성분시험법은 검체 중에 일반적으로 함유되어 있는 성분에 관한 시험법으로서 검체의 규격, 순도의 검사 및 영양가를 평가하기 위하여 수분, 회분, 질소화합물, 탄수화물(당질) 및 지질의 시험방법과 열량계산법에 대하여 기재한 것이다. 보통 검체중의 일반시험으로는 성상, 수분, 회분, 조단백질, 조지방 및 조섬유에 대하여 시험하고, 특별한 경우에는 비중, 각종 당류 및 지질 등에 대하여 시험할 필요가 있다. 일반적으로 당질은 검체 100g 중에서 수분, 조단백질, 조지방, 조섬유 및 회분의 양을 감하여 얻은 양으로서 표시하고 식품 중의 일반성분의 시험결과는 보통 백분율로 표시한다.

1) 수분

이 시험에서 수분이라 함은 건조감량법, 증류법 및 칼핏샤법에 따라 정량되는 것을 말한다.

(1) 건조감량법

① 상압가열건조법

이 시험법은 검체의 종류, 성질에 따라서 가열온도를 ㉮ 98～100℃ ㉯ 100～103℃ ㉰ 105℃전후(100～110℃) 및 ㉱ 110℃이상으로 한다. 즉 ㉮는 동물성 검체와 단백질 함량이 많은 검체 ㉯는 자당과 당분을 많이 함유한 검체 ㉰는 식물성 검체 ㉱는 곡류 등의 신속법으로 쓰인다.

가. 기구

㉮ 칭량접시

상부직경 55㎜, 하부직경 50㎜, 높이 25㎜ 또는 상부직경 75㎜, 하부직경 70㎜, 높이 35㎜로서 뚜껑이 있으며 중량은 전자가 약 25g, 후자가 약 35g의 알루미늄으로 만들어진 것을 사용한다.

㉯ 유리봉

해사(정제) 20g을 칭량접시에 옆으로 삽입했을 때 적어도 1.5㎝이상 해사로부터 나와 있어야 하며 뚜껑을 닫을 수 있을 정도의 길이일 것.

㉰ 자동조절기가 달린 건조기∶적어도 ±1℃이내의 온도조절이 가능해야 한다.

나. 시험법

미리 가열하여 항량으로 한 칭량접시에 검체 3～5g을 정밀히 달아(건조가 어려운 검체인 경우에는 20메쉬 정제해사 20g과 유리봉을 넣어 항량이 되게 하고 이에 검체를 넣어 잘 섞은 후 유리봉은 그대로 넣어 둔다), 뚜껑을 약간 열어 넣고 각 식품마다 규정된 온도의 건조기에 넣어 3～5시간 건조한 후 데시케이터 중에서 약 30분간 식히고 무게를 단다.

다시 칭량접시를 1～2시간 건조하여 항량이 될 때까지 같은 조작을 반복한다. 일반적인 것은 1회에 4시간 건조하여 수분량을 측정한다.

[계산식]

수분(%) ＝[eqn: rm { B—C} over { B—A}] × 100

A : 칭량접시의 무게(g)

B : 칭량접시와 검체의 무게(g)

C : 건조 후 항량이 되었을 때의 무게(g)

② 감압가열건조법

가. 기구

㉮ 칭량접시：앞의 ①항과 같은 것을 사용한다.

㉯ 자동조절기가 붙은 감압건조기 또는 수욕식 감압건조기

나. 시험법

100～110℃로 건조하여 항량으로 한 칭량병에 검체 2～5g을 정밀히 달아 넣고 일정온도로 조절하여(일반적으로 98～100℃) 감압건조기에 넣어 일정분압으로 감압하여 약 5시간 건조한다. 다음 세기병(황산)을 통하여 습기를 제거한 공기를 건조기 중에 조심히 넣어 건조기 내부) 상압으로 되었을 때 칭량병을 꺼내어 데시케이터에서 식힌 다음 무게를 단다. 다시 칭량병을 감압건조기에 넣고 1시간 건조하여 항량이 될 때까지 같은 조작을 반복한다. 단, 국수, 식빵 등은 미리 건조하여 가루로 한 다음 실시한다. 연유, 생계란 등은 해사와 유리봉을 넣은 칭량병을 수욕 상에서 미리 건조한 다음 실시한다. 유지류는 120～125℃에서 건조시간은 1시간으로 하여 전후 2회의 칭량에 있어서 중량의 차가 3㎎이하가 되었을 때 항량이 된 것으로 한다. 로얄제리 제품의 경우 검체 2~3g을 정밀히 달아 넣고 유리봉으로 잘 혼합한 후 이를 70±2℃의 감압건조기에 넣고 25±5㎜Hg로 감압하여 4시간 건조시킨 후 데시케이터에서 약 30분간 항량시킨 후 다음 계산식에  따라 수분함량을 구한다.

[계산식]

수분(%)＝[eqn: rm { B—C} over { B—A}]×100

A : 칭량병(해사, 유리봉 포함)무게(g)

B : 검체 및 칭량병 무게(g)

C : 건조 후 무게(g)

(2) 증류법

검체를 수분과 혼합되지 않은 유기용매 중에서 가열하면 검체중의 수분 또는 수분과 용매의 혼합증기가 증류된다. 이것을 냉각시켜서 눈금이 있는 냉각관에 모아서 유출된 수분의 양으로 한다.

가. 기구 및 시약

㉮ 증류식 수분정량 장치

㉯ 용매：키실렌 혹은 톨루엔

나. 시험법

검체(곡류, 콩류 및 해조류는 약 20g, 감자류, 생선류, 육류, 달걀 및 유제품은 약 5～10g, 야채과실은 약 5g)를 정밀히 달아 용량 500㎖의 증류 플라스크에 넣은 다음 돌비현상을 방지하기 위하여 완전히 건조한 정제 해사 소량을 넣는다. 검체가 잠길 수 있도록 충분한 양의 용매 150～200㎖를 넣은 후 그림1과 같은 장치에 눈금이 있는 수기와 냉각기를 연결하여 가열하고 최초의 용매가 1초간에 2～3방울의 비율로 냉각기에서 떨어지도록 가열을 조절한다. 눈금이 있는 수기에 수분이 모이지 않을 경우에는 가열을 늘려서 용매가 1초간에 4방울 정도 떨어지도록 한다. 유출액으로부터 수분을 완전하게 수집하기 위하여 냉각기의 상단에서 용매로 씻어 내린 후에 가열을 중지하고 눈금이 있는 관이 냉각되면 수분의 양을 읽는다.

그림 . 수분정량장치

[계산식]

검체중의 수분의 양 =[eqn: rm {V} over {S} × 100]

V：눈금이 있는 관에 든 물의 양(㎖)

S：검체의 채취량(g)

(3) 칼핏샤법

칼핏샤(Karl Fisher)법에 의한 수분정량은 피리딘 및 메탄올의 존재 하에 물이 요오드 및 아황산가스와 다음의 반응식과 같이 정량적으로 반응하는 것을 이용하여 칼핏샤시액으로 검체의 수분을 정량하는 방법이다.

[반응식]

▸H2O＋I2＋SO2＋3C5H5N＝2(C5H5N＋H)I-+C5H5N‧SO3

▸C5H5N‧SO3＋CH3OH＝(C5H5N＋H)O-SO2‧OCH3

▸H2O＋I2＋SO2＋3C5H5N＋CH3OH＝2(C5H5N＋H)I-＋(C5H5N＋H)O-SO2OCH3

가. 기구 및 시약

㉮ 적정장치

자동뷰렛 2개, 적정플라스크, 교반기 및 정전압 전류적정장치로 되어 있다. 칼핏샤시액은 흡수성이 매우 강하므로 장치는 외부로부터 흡수되지 않도록 만들어져야 한다. 방습제는 실리카겔 또는 염화칼슘(수분측정용)등을 사용한다.

㉯ 칼핏샤용 메탄올

메탄올 1ℓ에 마그네슘가루 5g을 넣어 염화칼슘관을 붙인 환류냉각기로 1시간 동안 환류하고 필요하면 염화제이수은 0.1g을 넣어 반응을 촉진시킨다. 가스발생이 멈춘 다음 습기를 피하면서 메탄올을 증류하여 습기가 들어가지 않도록 보존한다. 이 액 1㎖중의 수분은 0.5㎎이하이어야 한다.

㉰ 칼핏샤용 피리딘

피리딘에 수산화칼륨 또는 산화바륨을 넣고 마개를 꼭 막고 수일간 방치한 후, 그대로 습기를 피하면서 증류하여 습기가 들어가지 않도록 저장한다. 이 액 1㎖중의 수분은 1㎎이하이어야 한다.

㉱ 칼핏샤시액

Ⓐ 조제

요오드 63g을 칼핏샤용 피리딘 100㎖에 녹이고 방냉한다. 다음에 건조 아황산가스를 통하여 증가한 양이 32.3g에 이르렀을 때 아황산가스를 통하는 것을 멈추고 칼핏샤용 메탄올을 넣어 500㎖로 하고 24시간 이상 방치한 다음에 사용한다. 이 시액은 시간이 경과함에 따라 변화하므로 쓸 때마다 표정한다. 보관은 차광하여 습기를 피하고 찬 곳에 저장한다.

Ⓑ 표정

조작법에 따라 칼핏샤용 메탄올 25㎖를 적정플라스크에 취하고 미리 칼핏샤시액으로 종말점까지 적정하여 플라스크 안을 무수상태로 한다. 다음에 물 50㎎을 정밀히 달아 적정 플라스크에 빨리 넣고 세게 흔들어 섞으면서 칼핏샤시액으로 종말점까지 적정한다.

칼핏샤시액 1㎖에 해당하는 물(H2O)의 ㎎수 f를 다음과 같이 구한다.

f＝물(H2O)의 채취량/물(H2O)의 적정에 소비된 칼핏샤시액의 양(㎖)

㉲ 물‧메탄올 표준액

Ⓐ 조제

칼핏샤용 메탄올 500㎖를 1ℓ의 건조용량플라스크에 취하여 물 2.5㎖를 넣고 칼핏샤용 메탄올을 넣어 1ℓ로 한다. 이 표준액의 표정을 칼핏샤시액의 표정이 끝난 다음 곧 한다. 이 용액은 차광하여 습기를 피하여 찬 곳에 저장한다.

Ⓑ 표정

조작법에 따라 칼핏샤용 메탄올 25㎖를 건조적정 플라스크에 취하고 이것을 미리 칼핏샤시액으로 종말점까지 적정하여 플라스크 안을 무수상태로 한다. 다음에 칼핏샤시액 10㎖를 정확하게 넣고 조제한 물‧메탄올표준액으로 종말점까지 적정한다.

f′＝ f×10/적정에 소비된 물‧메탄올표준용액의 양(㎖)

나. 시험법

칼핏샤시액에 의한 적정은 습기를 피해야 하며 원칙적으로 이것을 표정했을 때의 온도와 같은 온도에서 적정하여야 한다. 적정플라스크중의 용액에 2개의 백금전극을 담그고 가변저항기를 적당히 조절하여 일정한 전류(5～10마이크로암페어)를 통하여 두고 칼핏샤시액을 적가하면 적정이 진행됨에 따라 회로중의 마이크로암미터의 바늘이 크게 흔들려 수초 내에 다시 원위치로 돌아온다. 적정의 종말점에 이르면 마이크로암미터의 흔들림(50～150마이크로암페어)이 30초간 또는 그 이상 지속된다. 이 상태가 되었을 때를 적정의 종말점으로 한다. 그러나 역적정일 때에는 칼핏샤시액이 과량으로 존재하는 경우 마이크로암미터의 바늘의 흔들림이 끊기고 종말점에 이르면 급히 원위치로 돌아온다. 마이크로암미터 대신 매직 아이(Magic eye)가 달린 전원차계를 쓸 수도 있다.

칼핏샤시액에 의한 적정은 따로 규정이 없는 한 다음의 어느 방법에 따라도 무방하다. 적정의 종말점은 보통 역적정을 할 때 명확하게 판별할 수 있다.

㉮ 직접적정

칼핏샤용 메탄올 25㎖를 건조 적정플라스크에 취하여 미리 칼핏샤시액으로 종말점까지 적정하여 플라스크 안을 무수상태로 한다. 다음에 수분 10～50㎎에 해당하는 검체를 정밀하게 달아 빨리 적정플라스크에 옮겨 넣고 세게 흔들어 섞으면서 칼핏샤시액으로 종말점까지 적정한다.

검체가 용매에 녹지 않을 경우에는 재빨리 가루로 하여 무게를 정밀하게 달아 신속하게 적정플라스크에 옮겨 습기를 피하면서 30분간 혼합 후 세게 흔들어 섞으면서 적정한다.

[eqn: rm수분(%)={검체의~적정에~소비된~칼핏샤시액의~양(ml)×f}over{검체의~양(mg)}×100]           [계산식]

f：시약의 역가

㉯ 역적정

칼핏샤용 메탄올 20㎖를 건조적정플라스크에 취하여 미리 칼핏샤시액으로 종말점까지 적정하여 플라스크 안을 무수상태로 한다. 다음에 수분 10~50㎎에 해당하는 검체(S ㎎)를 정밀하게 달아 빨리 적정플라스크에 넣고 과량의 칼핏샤시액 일정량(d ㎖)을 넣은 다음 세게 흔들어 섞으면서 물‧메탄올표준액으로 종말점까지 적정한다(소비량 e ㎖).

검체가 용매에 녹지 않을 경우에는 재빨리 가루로 하고 무게를 정밀하게 달아 신속하게 적정플라스크에 옮겨 과량의 칼핏샤시액 일정량을 넣고 습기를 피하면서 30분간 혼합 후 세게 흔들어 섞으면서 적정한다.

[계산식]

[eqn: rm수분(%)={df-ef'}over{S}×100]

f, f′: 시약의 역가

2) 회분

(1) 회화용기의 항량

깨끗한 회화용기를 전기로 또는 가스버너에서 600℃이상으로 여러 시간 가열한 후 데시케이터에 옮겨 실온으로 식힌 다음 곧 화학천칭으로 칭량한다. 다시 2시간 가열하여 건조 칭량하고 이 조작을 항량이 될 때까지 반복한다.

(2) 검체의 전 처리

검체를 회화용기에 정밀히 달아 넣고 필요하면 회화에 앞서 다음의 전 처리를 한다.

① 전 처리가 필요하지 아니한 검체

곡류, 두류, 기타 ② 이하의 항에 포함되지 않는 것

② 미리 건조하여야 하는 검체

수분함량이 많은 동물성검체는 건조기 내에서 될 수 있는 대로 건조시킨다. 액상검체는 수욕 상에서 증발 건조시킨다.

③ 예비 탄화시켜야 할 검체

회화할 때 팽창하는 검체로서 당류 및 당함량이 많은 검체, 정제전분 등이 속한다. 이들 검체는 버너의 약한 불로 주의하면서 탄화하든가 또는 열판상에서 적외선램프를 조사하면서 300℃이하에서 탄화한다.

④ 연소시켜야 할 검체

유지류는 가급적 수분을 제거하고 이것을 과열 또는 점화하여 불꽃이 약해질 때까지 연소시키고 적당한 뚜껑을 덮어 불을 끈다.

(3) 회화

위와 같이 전처리가 끝나면 용기를 그대로 회화로에 옮겨 550～600℃에서 여러 시간 가열하여 백색～회백색의 회분이 얻어질 때까지 계속한다. 회화가 끝난 후, 가열을 거치고 그대로 식혀 온도가 약 200℃로 되었을 때 데시케이터에 옮겨 식힌 후 칭량한다. 만일, 회화에 있어서 대량의 탄소가 남아 회백색의 회분을 얻을 수 없는 검체일 경우에는 얻은 흑회색의 회분을 식힌 다음 약 15㎖의 물을 가하여 탄 덩어리를 유리봉으로 부수어 수욕 상에서 잘 가온하여 가용분을 침출하여 정량 여과지로 작은 비커에 여과하고, 잔류물은 다시 물로 씻어, 씻은 액은 비커에 넣는다. 여과지상의 잔류물은 여과지와 같이 먼저의 회화용기에 옮겨 건조 후 550～600℃에서 회화시킨다. 비커의 액은 수욕 상에서 농축하여 잔류물을 회화한 먼저의 회화용기에 옮기고 소량의 물로 비커를 씻고, 씻은 액도 회화용기에 넣는다. 다시 회화용기를 수욕 상에서 증발 건조하고, 500～600℃에서 2시간 가열하면 탄소가 함유되지 아니한 회분을 얻는다.

회화한 다음 데시케이터에 옮겨 식히고 실온으로 되면 곧 칭량하여 검체의 회분량(%)을 다음 식에 따라 산출한다.

[계산식]

[eqn: rm회분(%)={{W_1}-{W_0}}over{S}×100]

W0：항량이 된 회화용기의 무게(g)

W1：회화 후의 회화용기와 회분의 무게(g)

S  ：검체의 채취량(g)

3) 질소화합물

(1) 총질소 및 조단백질

① 세미마이크로 킬달법

가. 기구 및 시약

그림 2와 같은 장치를 쓴다. 전체가 경질유리를 사용하여야 하며, 접속부위는 갈아 맞춘 것으로 하여도 좋다. 장치에 쓰는 고무는 수산화나트륨시액속에서 10～30분간 끓이고, 다음에 물에서 30～60분간 끓인 다음 물로 충분히 씻어서 쓴다(단, 동시험법의 원리를 이용한 기타의 장치 또는 자동‧반자동기기를 사용할 수 있다).

그림 . 세미마이크로킬달장치

A：킬달플라스크

B ：수증기 발생기로서 황산 2～3방울을 넣은 물을 넣고 갑자기 끓는 것을 피하기 위하여 비등석을 넣는다.

C：알칼리용액을 넣는 깔때기

D：수증기 유도관

E：내용물이 튀어 올라오는 것을 막는다.

F：작은 구멍(관의 안지름과 거의 같다.)

G, H：갈아 맞춘 접속부위

I ：냉각기(바깥지름 200㎜, 안지름 350㎜, 아래 끝은 약 5㎜)

J ：흡수용 플라스크

분해 촉진제：CuSO4 : K2SO4(1：4)

부런스위크(Brunswik)시액 : 메틸레드 0.2g 및 메틸렌블루 0.1g을 에탄올 300㎖에 녹여서 여과하여 사용하고 갈색병에 보존한다.

나. 시험법

＜검체의 분해＞

㉮ 통상적으로 질소(N) 함량이 2～3㎎에 해당하는 양의 검체를 정밀히 취하여 킬달플라스크에 넣고 여기에 분해 촉진제 약 0.5g을 넣은 후 플라스크 내벽을 따라 황산 3～5㎖를 넣은 다음 플라스크를 흔들어 주면서 30% 과산화수소 1㎖를 조금씩 조심하여 넣는다.

플라스크를 금망상에서 천천히 가열하고 검체의 탄화물이 보이지 않을 때까지 온도를 높여 끓이고 분해액이 투명한 담청색이 되면 다시 1～2시간 가열을 계속한다.

분해액을 냉각시킨 후 물 20㎖를 주의하여 가한 후 이 플라스크를 증류장치에 연결한다.

㉯ 비교적 많은 검체(예： 건조 된 제품류)를 취할 필요가 있는 경우에는 질소(N)함량이 약 20～30㎎에 해당하는 양의 검체를 정밀히 취하여 250～300㎖ 킬달분해플라스크에 넣고 이에 분해 촉진제 1～2g 및 황산 20～30㎖를 가하여 가열분해 시킨다.

분해액을 냉각시킨 후 물 약 100㎖를 가하고 200㎖ 메스플라스크에 옮겨서 냉각 후 물을 가하여 전량을 200㎖로 채워 그 20㎖를 세미마이크로 킬달분해플라스크에 취하여 증류장치에 연결한다.

㉰ 질소(N)함량이 적어서 다량의 검체를 취할 필요가 있는 경우에는 질소(N)함량 2～3㎎에 해당되는 검체를 정밀히 취하여 상기 ㉯의 조작과 같이 가열 분해하고 냉각 후 물 20㎖를 주의하여 가하고 킬달분해플라스크를 증류장치에 연결한다.

＜증류 및 적정＞

증류장치의 흡수플라스크에 0.05N 황산 10.0㎖를 취하여 이에 부런스위크시액 2～3방울을 떨어뜨려서 냉각기의 끝부분을 액면 밑에 담그고 작은 깔때기로부터 30% 수산화나트륨용액 25㎖를 가한다. 다음에 수증기 발생기로부터 수증기증류를 하여 증류액 약 100㎖를 받은 후 냉각기의 끝을 액면에서 조금 떼어 다시 유액 수 ㎖를 유취하여 다시 냉각기의 끝을 소량의 물로 수기 내에 씻어 넣는다. 수기 내에 들어 있는 유액을 0.05N 수산화나트륨액으로 부런스위크시액이 녹색으로 변할 때까지 적정한다. 따로 같은 방법으로 공시험을 한다.

[계산식][eqn: 질소(%) =0.7003×(a-b)×{{100}over{검체의채취량(㎎)}}]

a : 공시험에서 중화에 소요된 0.05N 수산화나트륨액의 ㎖수

b : 본시험에서 중화에 소요된 0.05N 수산화나트륨액의 ㎖수

0.05N 황산 1㎖ ＝ 0.7003㎎ N

계산식은 검체의 분해액을 전부 사용해서 적정했을 때의 식이므로 분해액의 일부를 사용할 때에는 그 계수를 곱한다. 여기서 얻은 질소량에 질소계수(6.25)를 곱하여 조단백질의 양으로 한다.

조단백질(%) = N(%)×질소계수(6.25)

(2) 아미노산

① 아미노산 자동분석기에 의한 정성 및 정량

가. 기구 및 시약

가) 기구

A：드라이아이스‧에탄올

B：가수분해용 시험관

C：진공코오드

D：트랩

E：마노메타

F：펌프

그림 . 단백질 가수분해장치

정온가열로：100～150℃의 온도범위에서 ±1℃로 제어 가능한 것이어야 한다.

나) 시약

㉮ 6N 염산： 염산(정밀 분석용 염산 20%)을 사용한다.

㉯ 과개미산용액：30% 과산화수소(특), 88% 개미산(특)을 1：9의 비율로 혼합하여 실온에서 한 시간 방치 후 0℃로 냉각한다. 사용시 제조한다.

㉰ 4.2N 수산화나트륨용액：사용시 제조한다.

㉱ 가용성전분： 아세톤으로 세척‧건조하여 사용한다.

㉲ 16%(w/v)트리클로로초산용액：50%(w/v)트리클로로초산을 사용 시 희석하여 사용한다. 50% 트리클로로초산용액은 냉암소에 보관한다.

다) 표준용액

아미노산 표준용액을 0.2N 구연산나트륨 완충액(pH 2.2) 또는 0.02N 염산용액으로 적당히 희석하여 사용한다.

라) 시험용액

Ⓐ 단백질구성 아미노산

시료는 동결건조를 한 후 분말로 하여 균질화한 것을 분석에 사용한다. 또 지방함량이 높은 시료는 동결건조 후 에테르에 침출, 탈지하여 사용한다.

㉠ 시스틴, 트립토판 이외의 아미노산 정량용 시험용액

단백질로서 약 10㎎을 함유하는 검체를 가수분해 시험관에 정밀히 달아 넣는다. 0.05%(w/v)2-멀캅토에탄올(C2H6SO)을 함유한 6N 염산을 단백질 양에 대하여 약 1,000배량 즉, 10㎖를 가한다. 드라이아이스‧에탄올로 동결한 후 탈기장치에 장착하여 융해, 동결을 수회 반복하며 충분히 탈기한다. 봉관하여, 정온가열로에서 110℃±1℃, 22～24시간 가수분해한다. 가수분해 종료 후 봉관을 절단하여 즉시 감압하여 40℃에서 농축 건조하여 염산을 제거한다. 염산을 최대한 제거하기 위하여 잔사에 물을 가해 다시 농축 건조한다. 0.2N 구연산나트륨 완충액(pH 2.2) 또는 0.02N 염산용액으로 일정량으로 만들어 시험용액으로 한다. 침전이 있는 경우에는 멤브레인 필터를 사용하여 여과한다.

㉡ 시스틴 정량용 시험용액

단백질 약 10㎎ 함유하는 시료를 정밀히 달아 미리 0℃로 냉각시켜 놓은 과개미산용액 10㎖를 가하여 단백질이 가용성인 경우 0℃에서 4시간, 불용성인 경우 0℃에서 하룻밤 방치한다. 방치 후 공기를 흡입하고 소량의 물을 가해 동결 건조한다. 잔사를 0.05%(v/v) 2 멀캅토에탄올 함유의 6N 염산 10㎖를 사용하여 가수분해 시험관으로 옮긴다. 동결한 후, 탈기장치에 장착하여 충분히 탈기한 후 봉관하여 110±1℃에서 18시간 분해한다. 이하 방법은 ㉠ 시스틴, 트립토판 이외의 아미노산 정량용 시험용액에 따라 시험용액을 조제한다.

㉢ 트립토판 정량용 시험용액

단백질 10㎎을 함유하는 시료를 가수분해 시험관에 정밀히 달아 넣고, 가용성전분 100㎎을 가한 다음 4.2N 수산화나트륨용액 3㎖를 가한다. 동결시킨 후, 탈기장치에 장착하여 충분히 탈기하고 밀봉하여 135±1℃에서 22시간 가수분해한다. 가수분해 후 봉관을 잘라 열고 6N 염산으로 중화하여 0.2N 구연산나트륨완충액(pH 4.25)으로 일정량을 만들어 시험용액으로 한다. 용액이 탁한 경우 30,000～40,000 rpm에서 30분간 원심분리하여 상등액을 취한다.

Ⓑ 유리 아미노산

㉠ 물에 의한 추출

고체 또는 페이스트상의 시료에 적용된다.

균질한 시료 약 1g을 정밀히 달아 약 10배량을 물을 가해 비등 수욕 상에서 가열하여 응고시킨 다음 여과하여 물층을 취한다. 잔사는 2～3회 소량의 물로 세정하고, 세액은 앞서의 물과 합한다. 지방이 있는 경우에는 에테르로 추출하여 제거한다. 물층을 감압하에 농축 건조하여 얻은 잔사를 0.2N 구연산나트륨 완충액(pH 2.2) 또는 0.02N 염산으로 용해하여 일정량으로 하여 시험용액으로 한다. 불용물질이 있는 경우에는 멤브레인 필터를 사용하여 여과한다.

㉡ 트리클로로초산법

액체상의 시료에 적용한다.

검체 1.0～3.0㎖를 시험관에 달아 16% 트리클로로초산용액을 동용량 가하여 15분간 진탕한다. 3,000rpm에서 15분간 원심분리하여 상등액을 시험용액으로 한다.

나. 시험방법

가) 아미노산 자동분석기 조건

완충액, 발색시약의 유무, 칼럼항온조의 온도를 점검하고, 자동완충액 전환기구 및 정유량 펌프, 유량을 소정의 조건에 따라 설정하고 측정을 실시한다. 정성분석을 위하여 표준물질과 시험용액을 동일한 조건에서 분석하여 머무름 시간이 일치하는 성분을 비교 동정한다. 또한 정량분석의 경우에는 미리 구해 놓은  농도의 아미노산표준의 피크 면적과 함량으로부터 검량 곡선을 작성한 다음 시험용액으로부터 얻어진 피크면적으로 시험용액중의 아미노산 함량을 계산한다.

나) 고속액체크로마토그래피에 의한 정성 및 정량

상기 가) 아미노산자동분석기에 의한 정량 및 정성에서와 같이 시험용액을 준비한다. 각각의 고속액체크로마토그래피에서 주어진 조건에 맞추어 유도체를 만든 후 검체와 동일 조건하에 조제한 아미노산표준용액의 피크면적과 함량으로부터 검량곡선을 작성하고 시험용액에서 얻어진 피크면적으로 시험용액중의 아미노산 함량을 계산한다.

(3) 단백질 분자량

① 분자량 측정법

가. 기구 및 시약

분자량 측정은 고속액체크로마토그래프를 사용하여 아래의 조건에 의해 측정한다.

① 단백질표준품

Ⓐ 난알부민 50,000 Ⓑ 트립신 24,000 Ⓒ Ribonuclease A 13,700 Ⓓ Neurotensin 1,673 Ⓔ Leucine Enkephalin 555.6			각각의 적당량을 취해 이동상 약 1㎖를 가해 용해하고 각각의 표준용액으로 한다.

단, 검량선의 조작에 대해서 표준품으로서 분자량 50,000으로 표시된 난알부민 사용을 필수로 한다.

② 시험용액의 조제

시료의 적정량을 달아 이동상 40㎖를 사용하여 용해하고 이동상을 더 가해 50㎖로 하고 0.45㎛의 멤브레인 필터에 통과시켜 시험용액으로 한다.

주) 검체 중의 단백질분해물이 이동상에 용해하지 않는 경우는 SDS(Sodium Dodecyl Sulfate) 1%를 이동상에 가해 사용한다.

나. 시험법

① 조작

표준용액 및 시료용액 10㎕로 하기 고속액체크로마토그래피 조건에 따라 시험한다.

② 고속액체크로마토그래피 조건

- Column(칼럼)∶~내경 7.8㎜, 길이 300～600㎜의 스텐레스관에 충전제로서 thiol화한 10㎛의 실리카겔(protein pak 125)을 충전한 것 또는 이와 동등한 기능을 가진 것을 사용한다(분자량 60,000이하가 분리 가능한 것).

- 이동상∶0.5M K2HPO4＋0.5M KH2PO4 pH 7.4

- 유속∶0.5㎖/min

- 검출∶UV 280㎚

- 온도∶실온

[계산식]

<규격성분의 함량>

검체 중의 규격성분 함량을 얻어진 피크면적의 수치를 사용하여 다음 식에 의해 계산한다.

분자량 50,000이하의 단백질 함량(%)＝검체중의 조단백질 함량(%) ×분자량 50,000이하의 성분의 피크면적 수치의 합/전용출성분의 피크면적 수치의 총합

4) 지질

(1) 조지방 추출

① 에테르추출법

㉮ 일반법

이 법은 주로 중성지질로 구성된 검체에 적용한다. 다만, 가열‧조리 등의 가공과정을 거치지 않은 검체에 적용된다. 필요한 경우 미세한 분말로 한 검체 2～10g을 달아 원통여과지에 넣고 검체 위에 탈지면을 가볍게 충전하여 이를 적당한 용기에 담아 100～105℃의 건조기에서 2～3시간 건조한 후, 데시케이터에서 식히고 속시레추출기(soxhlet)의 추출관에 넣는다. 받는 그릇에 무수에테르 약 1/2용량을 넣어 장치하고 8시간 추출한다.

추출이 끝난 후, 냉각기를 떼고 추출관 속의 원통여과지를 핀셋으로 꺼내고 다시 냉각기를 모두 추출관에 연결하여 수욕 상에서 가온하여 받는 그릇중의 에테르가 전부 추출관에 옮겨지면 받는 그릇을 떼어 수욕 중에서 에테르를 완전히 증발시킨다.

받는 그릇의 바깥을 거즈로 깨끗이 닦은 후, 98～100℃의 건조기에 넣어 약 1시간 항량이 될 때까지 건조한 다음 데시케이터에서 식히고 칭량한다.

조지방의 양은 다음 식에 따라 산출한다.

[계산식]

[eqn: rm조지방(%)={{W_1}-{W_0}}over{S}×100]

W0：받는 그릇의 무게(g)

W1：조지방을 추출하여 건조시킨 받는 그릇의 무게(g)

S ：검체의 채취량(g)

㉯ 특수법

이 법은 점질상으로서 분말로 하기 어렵고 또한 당분을 많이 함유한 검체에 적용한다.

검체 5～10g을 정밀히 달아 비커에 옮기고 물 약 200㎖를 넣고 잘 섞는다. 검체에 따라서는 저온 수욕 중에서 가온한다. 이 식힌 용액에 페링시액A 10㎖ 및 0.25N 수산화나트륨액을 순서대로 가하고 그때마다 잘 저어 리트머스시험지로 액성을 검사하고 중성～미산성이 될 때까지 0.25N 수산화나트륨액을 가한다.

다음에 잘 저어 섞어 침전을 침착시킨 다음 여과하여 침전을 여과지상에 될 수 있는 대로 모은다. 여과지에 묻어 있는 여액을 잘 제거한 다음 여과지와 침전은 함께 98～100℃의 건조기중에서 약 2시간 건조한 다음 원통여과지에 옮겨 속시레추출기의 추출관에 넣는다. 또한 침전이 조금 남아 있는 비커도 똑같이 잘 건조한 다음 에테르를 넣어 내부를 잘 씻고 묻어 있는 지질을 완전히 녹여 이 에테르액을 원통여과지에 붓고 같은 방법으로 세척을 되풀이하여 에테르가 추출관 중의 원통여과지를 통하여 받는 그릇에 들어가서 1/2용량이 넘으면 이하 상기 ㉮ 일반법에 따라 시험한다.

그림 4. 액체 추출기

페링황산제이구리용액：CuSO4‧5H2O 69.3g을 물 1,000㎖에 녹인다.

㉰ 액상검체의 추출법

이 법은 증발건조하기 어려운 검체에 적용한다. 액체추출기(그림4)의 추출관에 검체 30～50g을 정밀히 달아 넣고 아래쪽에 구멍이 있는 중관을 넣어 그 위쪽에 냉각관에서 에테르가 떨어질 수 있게 냉각관을 접속하고 이하 상기 ㉮ 일반법에 따라 시험한다.

② 뢰제‧곳트리브법

검체 1~10g을 정밀히 달아 뢰리히관, 마조니어관 또는 그의 지방추출관에 넣어 물을 가하여 약 11㎖로 하고 40～50℃로 가온한 후 흔들어 완전히 혼합하고 암모니아수 1.5㎖(액이 산성인 경우 2.0㎖)를 가하여 혼합하여 알코올 10㎖를 가하여 잘 섞는다.

다음 에테르 25㎖를 가하여 가볍게 섞고 마개를 열어 에테르증기를 날려 보낸 후 다시 마개를 닫고 약 1분간 세게 흔든다. 필요하면 냉각 후 석유에테르 25㎖를 가하고 다시 1분간 격렬히 진탕한다. 이를 600rpm에서 원심분리하거나 방치하여 상층액이 완전히 투명하게 되면 상층액을 미리 항량으로 한 삼각플라스크에 옮기고 관내의 남은 액에 에테르 및 석유에테르 각 15㎖씩으로 가하여 위와 같은 조작을 반복한다. 다시 석유에테르 및 에테르 15㎖씩으로 3회 추출한다. 다음 관의 마개 유출구 및 깔때기를 에테르, 석유에테르의 같은 양의 혼합액으로 깨끗이 씻고 여액 및 씻은 액을 삼각플라스크에 합쳐 수욕 상에서 용매를 날려 보낸 후 100±2℃의 건조기에 넣고 항량이 될 때까지 건조하고 조지방의 항량을 산출한다.

③ 산분해법

이 법은 물에 녹지 않고 산분해에 의해서 액상으로 되는 검체에 적용한다. 1～10g을 취하고 염산을 가하여 수욕 상에서 때때로 흔들면서 가열한 다음 식힌다. 이에 물 또는 에탄올을 가하여 10㎖～20㎖로 하고 내용물을 뢰리히관에 옮기고 비커는 에테르 25㎖로 씻어 뢰리히관에 넣고 흔든 다음 석유에테르 25㎖를 가하여 이하 상기 ②뢰제․곳트리브법에 따라 시험한다.

(2) 물리적 시험

① 비중

비중이란 물질의 질량과 그것과 같은 체적의 표준물질과의 질량의 비를 말한다.

㉮ 액체지방

비중병(용량 10~100㎖의 병으로서 온도계를 붙이는 갈아 맞춘 마개와 눈금 및 갈아 맞춘 뚜껑을 가진 측관이 있는 것)을 미리 깨끗하게 씻고 건조하여 그 무게(W)를 단 다음 마개와 뚜껑을 빼고 검체를 가득 넣은 후 따로 규정이 없는 한 규정온도(25℃)보다 1～3℃ 낮게 하고 거품이 남지 아니하도록 주의하여 마개를 막는다.

다음 천천히 온도를 올려 온도계가 표준온도를 나타낼 때 눈금보다 상부의 검체를 측관으로부터 제거하고 측관에 뚜껑을 하여 외부를 잘 닦은 다음 무게(W1)를 단다. 다시 같은 비중병으로 증류수를 사용하여 위와 같이 조작하고 그 무게(W2)를 달아 다음 식에 따라 비중(d)을 구한다.

[계산식]

[eqn: rmd={{W_1}-{W}}over{{W_2}-{W}}]

㉯ 고체지방

미리 깨끗이 씻어 건조한 스프렝겔피크노메타(뚜껑 k가 2개 있는 것)의 무게를 단다. 다음에 뚜껑 k를 열어 b관의 부속관 r을 끼우고 a관에 흡입관 s를 끼우고 부속관 r의 끝을 용융 지방중에 담그고 흡입관 s에서 흡인하여 지방은 가득 채운다. 100℃의 가온조에 피크노메타를 20～30분간 담그고 r과 s를 빼고 b관의 끝에 여과지를 대고 지방량을 a관내에 눈금에 닿게 한 다음 a, b관에 뚜껑을 덮고 건조거즈로 깨끗이 닦고 식힌 다음 무게를 단다.

그림 5. 지방용피크노메타

스프렝겔‧피크노메타

같은 피크노메타에 25℃의 증류수를 써서 같은 조작을 하여 무게를 달고 체지방의 계산식에 따라 비중을 계산한다.

② 굴절률

그림6. 압베굴절계

압베굴절계의 A, B 2개의 금속상자 중에서 각각 프리즘이 있어 D에서 E로 온탕을 흘려서 양프리즘을 일정한 온도로 가열한다. 프리즘을 열고 에테르로 적신 면으로 프리즘의 면을 깨끗이 닦고(사용한 다음도 같다) 굴절계의 A, B를 닫고 OK에서 관찰하고 전체 반사의 경계선(명암의 경계)이 눈의 교차점에 오도록 J를 움직여 프리즘을 회전하고 그때의 S상의 눈금을 루우베 L에서 보고 직접 굴절률을 읽는다.

(3) 화학적 시험

① 산가

[검체 전 처리]

건강기능식품 배합성분 중 유지성 물질 이외의 성분을 함유하는 경우 다음의 방법으로 유지를 채취하여야 한다.

검체를 분쇄 또는 세절하여 필요한 양(산가 및 과산화물가의 시험)의 유지가 얻어질 수 있도록 적당량을 공전삼각플라스크에 취하여 검체가 잠길 정도의 정제에테르를 넣고 때때로 흔들면서 약 2시간 방치한 후, 검체의 고형물이 유출되지 않도록 건조여지로 여과하고 다시 삼각플라스크중의 검체에 정제에테르(앞의 절반 정도의 양)를 넣어 흔들어 섞은 후 동일여지에 반복 여과한다. 여액을 분액깔때기에 옮기고, 이 여액의 약 1/2~1/3용량에 해당하는 물을 넣어 잘 흔들어 씻고 물층은 버린다. 이 조작을 2회 되풀이하고 에테르층은 분취하여 무수황산나트륨으로 탈수한 후, 질소가스 또는 이산화탄소를 통과하면서 40℃의 수욕 상에서 감압하여 에테르를 완전히 날려 보내고 남은 유지 약 10g을 정밀하게 달아 산가 시험방법에 따라 시험한다.

[시험조작]

산가라 함은 지질 1g을 중화하는데 필요한 수산화칼륨의 ㎎수이다. 검체 5~10g을 정밀히 달아 마개달린 삼각플라스크에 넣고 중성의 에탄올‧에테르혼합액(1：2) 100㎖를 넣어 녹인다. 이를 페놀프탈레인시액을 지시약으로 하여 엷은 홍색이 30초간 지속할 때까지 0.1N 에탄올성수산화칼륨용액으로 적정한다(다만, 검체가 착색되어 있을 때는 지시약은 1% 티몰프탈레인‧알코올용액이나 2% 알칼리블루-6B 알코올용액을 사용하던지 또는 검체를 소량으로 하여 상기 혼합액를 증량하여 시험한다).

[계산식]

[eqn: rm 산가={5.611×a×f} over {S}]

S：검체의 채취량(g)

a：0.1N 에탄올성 수산화칼륨용액의 소비량(㎖)

f：0.1N 에탄올성 수산화칼륨용액의 역가

② 요오드가

요오드가라 함은 일정한 측정법으로 측정한 지질 100g에 흡수되는 할로겐의 양을 요오드의 g수로 나타낸 것이다.

㉮ 하누스법

[시  약]

브롬요오드시액： 요오드 13.2g을 초산 1,000㎖에 가온하여 녹이고 이것을 25℃로 식힌 다음 20.0㎖를 취하여 0.1N 티오황산나트륨액으로 적정한다. 요오드용액의 나머지에 그중에 함유되는 요오드의 양과 당량의 브롬(약 3㎖)을 가한다. 이 액은 차광한 공전병에 보존한다.

[시험조작]

검체의 요오드가를 감안하여 다음 표에 따라 0.1~0.8g을 작은 유리그릇에 정밀히 달고 250㎖의 마개달린 삼각플라스크 중에 유리그릇과 같이 넣는다.

클로로포름 10㎖를 가하여 녹이고 여기에 브롬요오드시액 25㎖를 정확히 가하고 밀전하여 잘 섞고 차광하여 30분간(요오드가가 100이상의 것은 1시간) 방치한다. 다음에 1N 요오드칼륨액 30㎖를 가하여 흔들어 섞고 다시 물 100㎖를 가하여 유리한 요오드를 0.1N 티오황산나트륨액으로 적정한다(지시약 전분시액 1㎖). 따로 검체를 사용하지 않고 같은 방법으로 공시험을 한다.

[계산식]

[eqn: rm 요오드가={1.269×(b-a)×f} over {S}]

a：본시험에 있어서의 0.1N 티오황산나트륨액의 소비량(㎖)

b：공시험에 있어서의 0.1N 티오황산나트륨액의 소비량(㎖)

S：검체의 채취량(g)

f：0.1N 티오황산나트륨액의 역가

이 시험에서 만약 브롬요오드시액의 반량 이상이 소비되었을 때에는 검체를 감량하여 그 측정을 되풀이 한다.

요오드가	검체채취량(g)
120이상 60～120 60이하	0.1～0.2 0.2～0.4 0.4～0.8

㉯ 위이스법

[시  약]

일염화요오드시액

재승화시킨 요오드 13g을 초산 1,000㎖에 녹이고 그 일부에 대하여 티오황산나트륨액으로 적정하여 놓고, 이에 씻은 건조염소를 통하여 다시 일부에 대하여 티오황산나트륨액으로 적정하여 그 양이 최초의 적정량의 2배가 되도록 한다. 요오드는 약간 과잉의 정도로 한다. 이 시액은 공전갈색병에 넣어 파라핀으로 봉하고 사용직전에 연다. 30일 이상 지난 시액은 사용하면 아니 된다.

[시험조작]

검체의 요오드를 감안하여 적당량의 검체를 250㎖의 마개달린 삼각플라스크에 취하고 사염화탄소 15~20㎖를 가하고 일염화요오드시액 25㎖를 피펫으로 일정한 속도로 적가 한다. 다음에 암소에 30분간(요오드가가 100이상의 것은 1시간) 방치한 다음 1N 요오드칼륨액 20㎖ 및 물 100㎖를 가하여 흔들어 섞은 다음 유리한 요오드를 0.1N 티오황산나트륨액으로 적정한다(지시약 전분시액 1㎖). 같은 방법으로 공시험을 한다. 계산은 하누스법에 따라 한다.

③ 과산화물가

과산화물가라 함은 규정의 방법에 따라 측정하였을 때 유지 1㎏에 의하여 요오드칼륨에서 유리되는 요오드의 밀리당량수이다.

[검체 전 처리]

건강기능식품 배합성분 중 유지성 물질 이외의 성분을 함유하는 경우 제2 일반시험법, 1. 일반성분시험법 4) 지질 (3) 화학적시험법 ①산가의 검체 전 처리 방법에 따라 유지를 채취하여야 한다.

검체 약 1~5g을 달아 초산‧클로로포름(3：2) 25㎖에 필요하면 약간 가온하여 녹이고 쓸 때에 만든 포화요오드칼륨용액 1㎖를 가볍게 흔들어 섞은 다음 어두운 곳에 10분간 방치하고 물 30㎖를 가하여 세게 흔들어 섞은 다음 전분시액 1㎖를 지시약으로 하여 0.01N 티오황산나트륨액으로 적정한다. 따로 공시험을 하여 보정한다.

[eqn: rm과산화물가(meq/kg)={{(a-b)×f} over { 검체채취량(g)}}×10]

a：0.01N 티오황산나트륨액의 적정량(㎖)

b：공시험에서의 0.01N 티오황산나트륨액의 소비량(㎖)

f：0.01N 티오황산나트륨액의 역가

(4) 지방산

① 가스크로마토그래피에 의한 정성 및 정량법

<제1법>

㉮ 장치

가스크로마토그래프： 수소염이온화 검출기(FID)

㉯ 시약

Ⓐ 14% 트리폴루오로보란메탄올(125g BF3/ℓ MeOH)

Ⓑ 메탄올성 수산화나트륨용액(0.5N)

수산화나트륨 2g을 메탄올 100㎖에 녹인다. 장시간 방치하는 경우 흰 침전(Na2CO3)이 생길 수 있으나 이는 무시하여도 된다.

Ⓒ 헵탄

Ⓓ 내부표준용액：C11:0 triundecanoin 0.01g을 헵탄에 녹여 10㎖로 한다.

㉰ 표준용액의 조제

지방산 표준품 약 100㎎을 100㎖ 환저플라스크에 정밀히 취하고 0.5N 메탄올성수산화나트륨용액을 약 4㎖ 가한다. 플라스크 위에 환류냉각기를 설치하고 5～10분간 수욕 상에서 균질한 용액이 얻어질 때까지 가열한다. 그 후 14% BF3 약 5㎖를 환류냉각기를 통해 가하고 2분 동안 계속하여 가열한다. 마지막으로 n-헵탄 5㎖를 냉각기를 통해 가하고 1분간 더 가열한다. 수욕조와 냉각기를 제거하고 수 ㎖의 염화나트륨 포화용액을 가하여 플라스크를 휘저은 후 염화나트륨 포화용액을 더 가하여 헵탄층이 플라스크의 목 부분까지 올라오게 한다. 상층에서 약 1㎖의 헵탄을 취한 후 이에 소량의 무수황산나트륨을 가하여 탈수시킨 것을 표준용액으로 한다.

㉱ 시험용액의 조제

Ⓐ 지방 및 유지

검체를 환저플라스크에 정밀히 취하고 0.5N 메탄올성 수산화나트륨용액을 가한다. 플라스크위에 환류냉각기를 설치하고 5～10분간 수욕 상에서 균질한 용액이 얻어질 때까지 가열한다. 그 후 14% BF3를 환류냉각기를 통해 가하고 2분 동안 계속하여 가열한다. 마지막으로 n-헵탄 2～5㎖를 냉각기를 통해 가하고 1분간 더 가열한다. 수욕조과 냉각기를 제거하고 수 ㎖의 염화나트륨 포화용액을 가하여 플라스크를 휘저은 후 염화나트륨 포화용액을 더 가하여 헵탄층이 플라스크의 목 부분까지 올라오게 한다. 상층에서 약 1㎖의 헵탄을 취한 후 이에 소량의 무수황산나트륨을 가하여 탈수시킨 것을 시험용액으로 한다.

Ⓑ 지방산

검체를 환저플라스크에 정밀히 취하고 14% BF3를 넣은 후 Ⓐ 지방 및 유지의 “2분 동안 계속하여 가열한다.” 이후의 과정과 동일하게 조작한 것을 시험용액으로 한다.

주 1. 이중결합이 2개 이상인 지방산을 분석하는 경우에는 질소가스를 사용하여 메탄올과 플라스크의 공기를 제거한 후 사용하며, 시험용액은 가능한 한 빨리 분석한다. 장기간 보관할 경우에는 앰플에 넣어 냉동보관하거나 0.005% BHT를 첨가한다.

주 2. 검체의 양은 정확히 채취하여야 하며, 검체의 크기에 따라 플라스크의 크기와 시약의 양을 달리하여야 한다.

검체(㎎)	플라스크(㎖)	메탄올성수산화나트륨(㎖)	BF3시약(㎖)
100～250 250～500 500～500 750～1,000	50 50 100 100	4 6 8 10	5 7 9 12

* 가스크로마토그래피 분석의 경우 약 350㎎ 정도가 적당하다.

㉲ 시험조작

Ⓐ 가스크로마토그래피 조건

- 칼  럼：5% DEGS/크로모솔브 W(AW)

- 주입부온도：230℃～ 240℃

- 칼럼온도：190℃～ 195℃

- 검출기온도：230℃～ 240℃

- 캐리어가스 및 유량： 질소 40㎖/min

주 3. HP-1, Omegawax 등과 같은 모세관 칼럼(capillay column)을 사용할 수도 있다. 이 때 전 처리 방법은 위와 동일하며 다만, 검체의 양, 시약의 양, 첨가하는 내부표준물질의 양 및 희석배수를 분석에 맞도록 조절한다. 기기 조건은 <제2법>의 기기조건을 따른다.

주 4. 탄소수가 12이하인 경우에는 칼럼온도가 더 낮아야 하며, 탄소수가 20 이상인 경우에는 주입부, 칼럼, 검출기의 온도가 더 높아야 한다. 다양한 탄소수의 지방산을 한번에 분석할 경우에는 칼럼온도의 승온조작이 필요하다.

Ⓑ 정량시험

시험용액 및 지방산표준용액에 대하여 각각 1～5㎕를 주입하여 가스크로마토그래피를 행하고 이의 머무름 시간을 비교하여 정성을 한다. 정성의 경우와 동일한 조건에서 가스크로마토그래피를 행하여 얻은 각 지방산의 피크면적, 내부표준물질의 피크면적을 얻고 <제2>법에 따라 정량을 한다.

<제2법>

㉮ 장치

가스크로마토그래프： 수소염이온화 검출기(FID)

㉯ 시약

Ⓐ 14% 트리플루오로보란메탄올(125g BF3/ℓ MeOH)

Ⓑ 메탄올성 수산화나트륨용액(0.5N)

수산화나트륨 2g을 메탄올 100㎖에 녹인다. 장시간 방치하는 경우 흰 침전(Na2CO3)이 생길 수 있으나 이는 무시하여도 된다.

Ⓒ 이소옥탄： 가스크로마토그래피용

Ⓓ 내부표준용액

C11:0 triundecanoin 0.01g을 이소옥탄용액에 녹여 10㎖가 되게 한다(1000㎍/㎖).

㉰ 표준용액의 조제

지방산 표준물질 0.01g을 이소옥탄에 녹여 1,000㎍/㎖가 되게 한다. 내부표준물질 triundecanoic acid methyl ester 0.01g을 이소옥탄에 녹여 1,000㎍/㎖가 되게 한 후 이를 각각 혼합하여 (1:1) 각각이 500㎍/㎖가 되게 하여 표준용액으로 한다.

㉱ 시험용액의 조제

Ⓐ 지방 및 유지

검체 약 25㎎을 유리 튜브에 정밀히 취하고 내부표준용액 1㎖를 첨가한다. 이어 0.5N 메탄올성 수산화나트륨용액 1.5㎖를 가하고 질소를 불어넣은 후 즉시 뚜껑을 덮고 혼합한다. 이어 100℃ heating block에서 약 5분간 가온한다. 이를 냉각한 후 14% 트리플루오르보란메탄올용액 2㎖를 가하고 다시 질소를 불어넣은 후 즉시 뚜껑을 덮고 혼합하고 100℃에서 30분간 가온한다. 이어 30～40℃로 냉각하여 이소옥탄용액 1㎖를 가하여 질소를 불어넣은 후 뚜껑을 덮고 이 온도에서 30초간 격렬히 진탕한다. 다음 즉시 포화 염화나트륨용액 5㎖를 가하고 질소를 불어넣은 후 뚜껑을 덮고 진탕한다. 상온으로 냉각한 후 수층으로부터 분리된 이소옥탄층을 새 유리 튜브에 넣고 질소를 불어넣은 후 즉시 뚜껑을 덮는다. 수층에 이소옥탄 1㎖를  추가로 넣고 위와 같은 방법으로 추출한 후 이소옥탄층을 전의 이소옥탄액과 합한다. 이 액을 무수황산나트륨으로 탈수하고 질소를 불어넣은 후 분석 전까지 밀봉한다.

㉲ 시험조작

Ⓐ 가스크로마토그래피 조건

- 칼럼: SP-Omegawax 320 (Capillary column ; polyethyleneglycol 100% ; 30m × 0.32 ㎜ × 0.52 ㎛) 또는 이와 등등한 것

- 주입부온도：250℃

- 칼럼온도：200℃

- 검출기온도：260℃

- 유량：1.0㎖/min

- split ratio ; 10 : 1

Ⓑ 정성시험

시험용액 및 지방산표준용액을 각각 1～2㎕를 주입하여 RRT(Relative Retention Time ; 내부표준물질에 대한 각 지방산들의 머무름 시간의 비)를 사용하여 각각의 지방산을 확인한다.

Ⓒ 정량시험

정성시험법에 의해 얻은 각 지방산의 피크면적, 내부표준물질의 피크면적으로부터 다음과 같이 정량을 한다.

[계산식]

지방산(㎎/100g)＝ STc×(SAfa/STfa)×fFAi ×(STis/SAis)×

(최종희석용액(㎖)/SA취한양(g))×1.0067×(100/1,000)

STc   : 표준물질용액의 농도

fFAi   : 지방산 메틸에스테르로부터 지방산으로의 전환계수 (표1-2)

1.0067 : 내부표준물질(C11:0) 트리글리세라이드로부터 지방산으로의 전환계수

STfa  : 표준물질의 피크면적

SAfa  : 시험용액내 표준물질의 피크면적

STis  : 표준물질용액내 내부표준물질 피크면적

SAis  : 시험용액내 내부표준물질 표준면적

표 1-2.
지방산명	fFAi
12:0	0.9346
14:0	0.9421
14:1	0.9417
16:0	0.9481
16:1	0.9477
18:0	0.9530
18:1	0.9527
18:2	0.9524
18:3	0.9520
18:4	0.9517
20:5	0.9557
22:5	0.9593
22:6	0.9590

(5) 콜레스테롤

① 가스크로마토그래피에 의한 정량

[장치]

가스크로마토그래피, 수소염이온화 검출기(GC-FID)

[시약조제]

- 2N 수산화칼륨 에탄올용액 : 수산화칼륨 13.2g을 소량의 물로 녹이고 에탄올을 가하여 100㎖로 한다.

- 5α 콜레스탄 내부표준물질용액 : 5α 콜레스탄 20.0㎎을 헥산에 녹여 10㎎으로 한다.

- 콜레스테롤 표준용액 : 콜레스테롤 20.0㎎을 헥산에 녹여 10㎖로 한다.

- 가스크로마토그래피용 칼럼 충진제: 2% SE-30/Gas chrom Q(60~80메쉬) 또는 2% OV-17/Gas chrom Q(60~80메쉬) 또는 이와 동등한 것

- 시험용액의 조제

검체 약 1~10g(콜레스테롤함량 20~1,000㎎/100g)에 물 약 8㎖와 5α 콜레스탄 1㎖를 가하여 혼합 균질화한다. 이것을 분액여두에 옮겨 클로로포름 : 메탄올(2:1) 200㎖를 가하여 약 5분간 진탕혼합 추출하여 방치한 후 클로로포름층을 취하고 검액 잔류물에 다시 클로로포름 : 메탄올(2:1) 100㎖씩 2회 추출한다. 추출한 클로로포름층을 합하여 0.5% 수산화나트륨용액 100㎖로 세척하고 무수황산나트륨으로 탈수한 후 여과하여 40℃이하에서 클로로포름층을 감압 농축한다. 감압 농축한 잔류물에 2N 수산화칼륨 에탄올용액 20㎖를 가하여 환류냉각기를 붙여 85℃에서 1시간 비누화한 후 냉각하여 물 약 20㎖를 분액여두에 옮기고 에테르 약 20㎖씩 3회 추출한다. 에테르추출액을 모두 합하여 물 20㎖씩으로 세척하여 페놀프탈레인 지시약으로 홍색이 나타나지 않을 때까지 세척한다. 에테르층을 무수황산나트륨으로 탈수한 후 여과하여 감압 농축한다. 잔류물을 헥산 1㎖에 녹여 시험용액으로 한다.

[장치 및 시험조건]

① 가스크로마토그래피의 측정조건

- 칼럼 : 안지름 2~3㎜, 길이 2m의 유리관

- 충전제 : 2% SE-30/Gas chrom Q(60~80메쉬) 또는 2% OV-17/Gas chrom(70~80메쉬) 또는 이와 동등한 것

- 검출기 : FID(수소염이온화 검출기)

- 캐리어 가스 및 유량 : 산소(O2), 50㎖/min

- 칼럼 온도 : 260~270℃

- 주입부 온도 : 280~300℃

- 검출기 온도 : 280~300℃

② 칼럼시험

시험용액 1~5㎕를 가스크로마토그래프 내에 주입하여 시험용액 중 콜레스테롤의 피크면적 또는 높이와 내부표준물질의 피크면적 또는 높이를 구하고 다음 식에 따라 검체중의 콜레스테롤함량을 계산한다.

【환산계수 작성】

콜레스테롤 표준용액 0.05, 0.1, 0.2, 0.4, 0.8, 1.0㎖를 각각의 시험관에 취하여 5α 콜레스탄 내부표준물질 용액 0.4㎖씩 가하여 헥산으로 정확하게 2㎖로 되게 한다. 각각 2㎕를 가스크로마토그래프 내에 주입한다. 그래프의 횡축에 내부표준물질에 대한 표준물질의 중량비를 구하고 종축에 면적비 또는 높이비를 구하여 작성한다. 피크 면적비 또는 높이비가 1.0의 중량비를 표로부터 구하여 환산계수(중량비/피크 면적비 또는 높이비)로 한다.

[계산식]

검체중의 콜레스테롤(mg/100g)＝[eqn: rm { 2×K×P sub1 ×100} over {검체 채취량(g)×P sub2 }]

P1 : 콜레스테롤의 피크면적 또는 높이

P2 : 5α 콜레스탄의 피크면적 또는 높이

K : 환산계수

5) 탄수화물

(1) 당질

① 단당류 및 이당류

㉮ 여지크로마토그래피에 의한 정성

[시  약]

Ⓐ 전개용매

㉠ n- 부탄올： 초산： 물(4：1：2)

㉡ n- 부탄올： 피리딘： 물(6：4：3)

Ⓑ 발색액

㉠ 암모니아성질산은용액

n-부탄올에 동량의 10% 암모니아수를 가하여 흔들어 섞고 정치한 다음 상층을 취하여 질산은의 분말을 2%의 비율로 가하여 녹이고 필요하면 상층부를 분리하여 사용한다. 쓸 때에 만든다.

㉡ ρ- 아니시딘염산용액： 부탄올‧에탄올‧물(4：1：1)혼합액에 ρ-아니시딘염산염을 3%, 염화제일석을 약 0.01%의 비율로 가하여 녹인다.

㉢ 레소르신‧염산용액：1% 레소르신‧에탄올용액에 동량의 0.2N 염산을 가한다.

[시험조작]

Ⓐ 검액의 조제

검체중의 당량에 따라 그 일정량(1～5g)을 취하여 유발에 옮기고 50% 에탄올 20～50㎖를 가하여 섞어서 균등한 시럽 상으로 한다. 다음 이를 원심분리하고 상징액이 필요하면 여과지를 사용하여 여과하여 검액으로 한다. 검액 중의 당량은 1～4% 정도가 적당하다.

Ⓑ 전개

검액 및 대조의 당액 2～5㎕를 마이크로피펫 또는 유리모세관을 사용하여 여과지에 찍고 전개용매 ㉠ 또는 ㉡ 중의 어느 것을 사용하여 상승법에 따라 전개를 한다.

Ⓒ 발색

발색액 ㉠ 또는 ㉡ 중의 어느 것을 분무한 다음에 100～105℃에서 5～10분간 가열하여 발색시킨다. 2당류는 110～120℃에서 10～15분간 정도 가열하지 않으면 반점을 명확하게 인정하기 곤란하다. Ⓑ 발색액 ㉠은 갈색～흑갈색의 반점이 나타나고 ㉡은 당의 종류에 따라서 다르나 황～적갈색의 반점이 나타난다. 발색액 ㉢은 케토오스 또는 자당의 검출에 사용한다. 어느 경우에도 대조의 당류 Rf값 색조와 비교하여 정성한다.

표 1-3. 당류의 발색시약과 정색

정색시약 당 류	발색액㉠ 암모니아성질산은	발색액㉡ ρ-아니시딘염산	발색액㉢ 레소르신염산
알도펜토오스 알도헥소오스 케토헥소오스 유당 맥아당 자당 우론산	흑갈색 갈색 갈색 다갈색 다갈색 - 갈색	적갈색 황갈색 황색 담황갈색 담황갈색 담황갈색 도적색	- - 적색 - - 적색 -

*전개할 때 대조의 당액을 쓰는 이유： 검액중의 당의 종류가 미지일 경우에는 보통 식품 중에 존재하기 쉬운 당류 즉 포도당, 과당, 자당, 유당 및 맥아당을 대조용액으로 하고 그의 농도는 1～2%로 한다.

Rf값에 있어 당류의 Rf값은 여과지의 종류, 전개온도 등에 좌우되므로 표 1-4.에 나타낸 값은 참고 정도로 하고 시험을 할 때에는 반드시 대조의 당류 Rf값과 비교하여 판정하도록 한다.

표 1-4. 당류의 Rf

전 개 액 당 류	n-부탄올：피린딘：물 (6：4：3)	n-부탄올： 초산： 물
		(4：1：5)	(4：1：2)
D-글루코오스 D-갈락토오스 D-만노오스 D-후락토오스 D-키실로오스 D-알라비노오스 D-리보오스 L-람노오스 유당 맥아당 자당 D-글루클론산 D-글루클로노락톤 D-글루코사민염산염 D-갈락토사민염산염	0.39 0.34 0.46 0.42 0.50 0.43 0.56 0.59 0.24 0.32 0.40 0.16 0.72 0.32 0.28	0.18 0.16 0.20 0.23 0.28 0.21 0.31 0.37 0.09 0.11 0.14 0.12 0.33 0.13 0.12	0.30 0.28 0.35 0.33 0.36 0.36 - 0.46 0.17 0.19 0.23 - 0.42 0.28 -

② 환원당

㉮ 벨트란법

Ⓐ 검액의 조제

환원당으로서 0.2～1.0g에 대응하는 검체(액상 검체는 수욕 상에서 증발 건조하여 사용하고 검체가 다량의 지방질을 함유하였을 때는 에테르로 침출하여 탈지한다. 그리고 검체가 산성일 경우에는 탄산칼륨 적당량을 가하여 이에 중화한다)를 200㎖의 삼각플라스크에 취하고 80v/v% 에탄올 100㎖를 가하여 환류냉각기를 달고 1시간 수욕 상에서 가온한다.

식힌 다음 이 내용물을 250㎖의 메스플라스크에 옮기고 삼각플라스크는 에탄올로 씻는다. 이에 에탄올을 넣고 전량을 250㎖로 하여 잘 흔든다.

이 상징액 100㎖를 비커에 취하고 증발하여 2～3㎖가 되게 하고(에탄올을 완전히 날려 보낸다) 물 약 30㎖를 가하여 잘 흔들고 중성초산납용액을 침전이 그 이상 생기지 않을 때에는 가하고 섞은 다음 약 15분간 방치하고 여과한다. 여과지상의 잔류물을 물 5㎖로 3회 씻는다. 여액에 10% 황산나트륨용액을 침전이 그 이상 생기지 않을 때까지 가하여 납을 제거한 다음 건조여과지로 여과하고 잔류물은 물 5㎖로 3회 씻고 여액에 물을 넣어 100㎖로 한다.

Ⓑ 시험조작

검액 20㎖(당량은 0.05～0.45%이어야 한다)를 200㎖의 삼각플라스크에 넣고 벨트란시액 A 및 B액 각 20㎖를 가하여 흔들어 섞은 다음 금망상에서 정확하게 3분간 조용히끓인다.

식힌 후 아린관에 상징액을 기울여 넣고 조용히 흡인 여과한 다음 물 약 50㎖를 삼각플라스크에 내벽에 따라 조용히 주입하여 흔들어 아산화동의 침전을 씻어 다시 아린관에 흡인 여과한다.

이 조작을 3～4회 반복하여 침전을 완전히 씻은 다음 알칼리성이 없어질 때까지 더운 물로 씻는다. 이때 아산화동이 공기와 접촉하지 않도록 주의한다.

다음 받는 그릇을 교환한 후 벨트란시액 C액 약 20㎖를 삼각플라스크에 넣어 아산화동을 녹이고 이를 앞의 아린관에 3～4회로 나누어 조용히 흡인하면서 침전을 완전히 녹인다. 다음 더운 물 약 100㎖로 아린관을 여러 번 씻은 후 이를 벨트란시약 D액으로 연한 홍색이 될 때까지 적정한다. 이에 소비된 벨트란시액 D액의 소비량(㎖)으로부터 구리의 양을 산출하고 부표중의 벨트란당류정량표에 의하여 당량을 구하여 다시 검체 중의 당량을 산출한다.

㉯ 소모기법

이 법은 주로 미량의 당을 정량할 때에 사용한다.

[시  약]

동시약：제이인산나트륨(Na2HPO4‧12H2O) 71g, 주석산칼륨나트륨 40g을 물 약 400㎖에 녹인 다음 1N 수산화나트륨액 100㎖를 가하여 저어 흔들어 섞으면서 액면까지 달하는 깔때기를 사용하여 황산제이동용액(CuSO4‧5H2O 10g → 100㎖) 80㎖를 가한다. 다음 황산나트륨(Na2SO4‧10HSO) 410g을 가하여 녹이고 1N 요오드산칼륨용액(KIO3 3.567g → 100㎖) 25㎖를 가하여 물로써 1,000㎖로 한다. 이것을 1～2일간 방치한 다음 여과하여 착색병에 저장한다. 이 시약은 포도당 0.01～3㎎/5㎖를 정량할 수 있지만, 1㎎/5㎖가 적당하다. 포도당의 양이 1㎎/5㎖이하의 경우에는 요오드산칼륨용액을 10㎖, 0.5㎎/5㎖ 이하의 경우에는 5㎖로 감하는 것이 좋다.

2.5% 요오드칼륨용액： 미량의 탄산나트륨용액으로 알칼리성으로 한다.

0.005N 티오황산나트륨액： 티오황산나트륨(Na2S2O3‧5H2O) 약 25～26g에 10% 수산화나트륨용액 2㎖ 및 물을 가하여 녹여 전량을 1,000㎖로 하여 0.1N의 원액을 만들고 쓸 때에는 원액을 20배로 희석하여 조제한다.

적정： 1N 요오드산칼륨액을 정확히 200배로 희석하여, 0.005N 요오드산칼륨액을 만들고 그 10.0㎖를 취하여 2.5% 요오드화칼륨용액 1㎖ 및 2N 황산 2㎖를 가하여 5분간 방치한 다음 0.005N 티오황산나트륨액으로 적정한다.

Ⓐ 검액의 조제

전항의 ㉮ 벨트란법 Ⓐ 검액의 조제에 준한다.

[시험조작]

검액 및 대조액으로서의 물 각 5㎖를 시험관(25×200㎜)에 취하고 각각 동시 약 5㎖를 가한다.

시험관은 유리구로 마개를 한다(또는 마개달린 시험관을 사용하여 느슨하게 마개를 하여도 좋다). 이어 세게 끓는 수욕 중에 잠기게 한다(각 환원당의 가열시간은 표1-5에 따라 한다). 다음 찬물로서 식힌 후 요오드화칼륨용액 2㎖를 천천히 넣고 이어 2N 황산 1.5㎖를 빨리 넣고 흔들어 섞어 침전을 완전히 녹인다.

이어 석출한 요오드를 5분 후 0.005N 티오황산나트륨액으로써 0.5% 전분시액 1㎖를 지시약으로 하여 적정한다. 뷰렛은 0.05㎖의 눈금이 있는 것을 사용한다. 환원당의 양은 다음 식에 따라서 계산한다.

[계산식]

검액 5㎖중의 환원당의 양(㎎) ＝ [(대조액의 적정㎖수)-(검액의 적정㎖수)]×환원당의 계수(표 1-5. 참조)

표 1-5. 환원당의 가열시간 및 계수

당의 종류	가열시간(분)	계수
아라비노오스 키실로오스 글루코오스 후락토오스 만노오스 갈락토오스 전화당 맥아당 유당	25～35 25～35 15～25 15～25 25～35 35～45 15～25 25～35 30～40	0.143 0.127 0.135 0.135 0.135 0.175 0.135 0.260 0.216

③ 자당

㉮ 벨트란법

전항의 검액의 조제에 따라 0.5～1%의 자당이 함유되도록 만든 검액 100㎖를 250㎖의 삼각플라스크에 넣고 0.1N 염산 30㎖를 가하여 이에 유리관을 달고 비등 수욕중에서 30분간 가열한 후 식힌다.

다음 0.1N 수산화나트륨액 30㎖를 가하여 중화하고 물로써 전량을 250㎖로 한다. 이 용액 20㎖를 취하여 ② 환원당 ㉮ 벨트란법에 따라 전화당의 양을 구하고 이에 0.95를 곱하여 자당의 양으로 한다. 검체 중에 환원당이 함유되어 있을 때는 ② 환원당에 따라 산출한 구리의 양을 여기에서 얻은 구리의 양으로부터 감하여 그 나머지 구리의 양에 상당하는 전화당을 구하고 이에 0.95를 곱하여 자당의 양을 산출한다.

㉯ 소모기법

자당용액(0.15% 이하)을 앞의 벨트란법에 따라 가수분해하여 검액으로 한다. 그 5.0㎖를 취하여 앞의 ② 환원당의 소모기법에 의한 환원당의 정량법과 같이 조작해서 전화당을 정량하고 이에 0.95를 곱하여 자당의 양으로 한다. 검체 중에 환원당이 함유되어 있을 때에는 가수분해하지 아니한 용액에 대하여 직접 환원당에 상당하는 적정수를 구하고 이에 전화당의 계수를 곱하여 얻은 값을 위의 가수분해에 의하여 얻은 전화당의 양으로부터 감하고 이에 0.95를 곱하여 자당의 양으로 한다.

㉰ 선광도측정에 의한 법

[장  치]

선광계

[시험조작]

검액(환원당의 검액의 조제에 준하여 만든다)을 시료관에 넣고 나트륨스펙트럼의 D선을 광원으로 하여 선광계를 써서 선광각(α)을 측정한다. 자당의 양은 다음 식에 따라 구한다.

[계산식]

[eqn: rm자당(g/검액100ml)={100α} over {[α]b×itl)}]

[α]b：측정시의 온도 t℃에 있어서의 선광도, l：시험관의 길이(dm)

측정 시에 온도를 20℃라 하면 자당의 20℃에 있어서의 비선광도는 [α]b＝66.5이므로 이를 위의 식에 대입하면

[eqn: rm자당(g/검액100ml)={100 over 66.5}×{α} over{itl}=1.504×{α} over{itl}]

(단, 분말설탕의 경우는 계산된 값에 계수 6을 더한다.)

로 되며 측정에 2dm(200㎜)의 시료관을 사용할 때에는 자당(g/검액 100㎖)＝0.752α로 된다.

또 이때에 물 100㎖중에 자당을 함유하는 검체 a g이 녹아 있을 때 그 검체 중의 자당 함량을 x%라 하면 검액 100㎖중의 자당량은 ax/100(g)이다. 따라서 위의 식으로부터

[eqn: rm{ax}over{100}}=0.752α~~~~~~~ x(%)={75.2α} over {rma}]

④ 기기분석법에 의한 당류의 정성 및 정량

㉮ 장치

고속액체크로마토그래프

㉯ 표준용액의 조제

과당, 포도당, 설탕의 표준품을 각각 100㎖용 메스플라스크에 정밀히 달아 물 50㎖로 녹인 후 아세토니트릴로 100㎖까지 채운다.

㉰ 시험용액의 조제

검체 약 5g을 50㎖ 메스플라스크에 정밀히 달아 물 25㎖를 가하여 녹인 후 아세토니트릴로 50㎖까지 채운다. 이를 0.45㎛의 멤브레인 필터로 여과한 것을 시험용액으로 한다.

㉱ 시험조작

Ⓐ 고속액체크로마토그래피 조건

㉠ 칼럼： 길이 300㎜, 안지름 4㎜, μ-Bondapak/Carbohydrate 상당품

㉡ 검출기： 시차굴절계(RI)

㉢ 이동상： 물： 아세토니트릴(17：83)

㉣ 유속：1.0㎖/min

㉤ 칼럼온도： 실온

Ⓑ 정량시험

시험용액 및 표준용액을 각각 10㎕씩 주입하여 얻은 피크의 넓이 또는 높이를 구하여 검량선을 작성한 후 시험용액의 당질의 농도(㎍/㎖)를 구하고, 다음 식에 의해 검체 중 당의 함량(㎎/100g)을 산출한다.

[eqn: rm당함량(mg/100g)=S×{{a×b}over검체채취량(g)}×{100}over{1,000}]

S：시험용액중의 당질의 농도(㎍g/㎖)

a：시험용액의 전량(㎖)

b：희석배수

(2) 조섬유

그림 7. 여과관

① 헨네베르크‧스토오만개량법에 의한 정량

[기  구]

여과관 : 그림 7과 같이 여과면에 구리망을 씌운 다음 그 위에 린넨(linnen)을 평평하게 덮고 끈으로 묶어 여과관을 만든다.

a：약 20메쉬의 구리망

b：1인치에 약 45수의 린넨

[시험조작]

검체 2～5g을 정밀히 달아 에테르로 5～6회 씻어 탈지하고(조지방 정량 후의 탈지검체를 이 시험에 사용하여도 무방하다) 500㎖의 플라스크에 넣고 석면 약 0.5g을 가한다. 뜨거운 1.25% 황산 200㎖를 넣고 즉시 환류냉각기를 달아 1분 이내에 끓기 시작하도록 가열한다.

끓기 시작하면 조용히 끓도록 버너를 조절한다. 때때로 플라스크를 흔들고 기포가 심하게 일어나면 아밀알코올 0.5㎖를 냉각기의 상부로부터 가한다.

정확히 30분간 끓인 다음 냉각기를 떼어 내고 플라스크에 여과관을 넣어 흡인여과한다. 열탕으로 세액이 산성을 나타내지 않을 때까지 플라스크와 잔류물을 4～5회 씻는다.

다음 뜨거운 1.25% 수산화나트륨용액 200㎖를 사용하여 잔류물을 500㎖의 플라스크에 씻어 넣고 3분 후에 끓기 시작하도록 가열한다. 끓기 시작하면 조용히 끓도록 버너를 조절하고 정확히 30분이 되면 유리여과기(1G-3)를 사용하여 흡인여과한다.

세액이 알칼리성을 나타내지 아니할 때까지 4～5회 열탕으로 씻은 다음 에탄올 15㎖로 씻고 110℃의 건조기에서 건조하여 에테르로 씻은 다음 항량이 될 때까지 다시 건조하여(약 1시간) 데시케이터에서 식히고 칭량한다.

다음 450～500℃의 전기로 중에서 항량이 될 때까지 가열하고(약 1시간) 식힌 후 칭량하여 다음 식에 따라 조섬유의 양을 구한다.

[계산식]

[eqn: rm조섬유(%)={{W_1}-{W_2}}over {S}]

W1：유리여과기를 110℃로  건조하여 항량이 되었을 때의 무게(g)

W2：전기로에서 가열하여 항량이 되었을 때의 무게(g)

S ： 검체의 채취량(g)

② 퀘닛히법에 의한 정량

이 퀘닛히법은 펜토오산 양이 비교적 많은 검체에 적용한다.

[시  약]

㉮ 글리세린황산： 황산 20g에 글리세린(비중 1.23)을 가하여 정량을 1,000㎖로 한다.

[시험조작]

건조한 검체(5～14%의 수분을 함유하는 것) 3g을 500～600㎖의 유리병 또는 도자기 접시에 취하고 글리세린황산 200㎖를 가하여 때때로 흔들거나 유리봉으로 잘 저어 섞어 이에 환류 냉각기를 달아 133～135℃에서 1시간 끓이거나 또는 가압기(3기압)중에서 137℃로 1시간 가열한 다음 식히고 유리병 또는 도자기접시의 내용물을 희석해서 약 400～500㎖로 하여 다시 1시간 끓이거나 가열하고 더울 때 대형 구우치도가니를 써서 석면 상에서 흡인여과 하여 잔사를 약 400㎖의 열탕으로 씻은 다음 처음에는 따뜻한 에탄올로, 나중에는 에탄올‧에테르혼합액으로써 씻고 여액이 완전히 무색으로 된 다음 잔사를 구우치도가니와 함께 105～110℃에서 항량으로 될 때까지 건조하여 칭량으로 다음 위의 ①법에 따라 회화하고 다시 칭량하여 전후의 칭량차를 조섬유의 양으로 한다.

10% 이상의 지방을 함유하는 물질은 미리 탈지한다. 즉, 검체를 석면을 깐 구우치도가니에 달아 넣고 흡인장치에 접속한 다음 먼저 비등 무수에탄올로 씻고 에테르로 씻어 탈지한다. 위의 ①법 및 ②법에 따라서 얻은 조섬유는 일부의 함질소물을 함유하는 일이 있다. 이 때에는 따로 검체를 취하여 같은 방법으로 처리하여 얻은 조섬유를 회화하지 아니하고 세미마이크로킬달법에 따라 질소를 정량하고 이에 6.25를 곱하여 조단백질의 양을 산출해서 처음에 얻은 조섬유의 양으로부터 뺀다.

(3) 식이섬유

① 제1법

본 시험법은 총식이섬유, 물불용성식이섬유, 수용성식이섬유의 시험에 적용한다. 단, 수용성식이섬유 중 난소화성말토덱스트린 등 일부 수용성식이섬유는 제2법으로 시험한다.

㉮ 장치

Ⓐ 기공 40～60㎛, 용량 60㎖의 유리여과기：525℃에서 한 시간 처리한 후 식혀 물로 세척한 후 상온 건조하여 셀라이트 0.5g을 가한 후 130℃에서 항량이 될 때까지 건조한 후 데시케이터에 옮겨 보관한다.

Ⓑ 감압펌프：역류방지장치가 부착된 것

Ⓒ 감압건조기 또는 상압가열건조기

Ⓓ 데시케이터

Ⓔ 회화로

Ⓕ 수욕조

Ⓖ pH 측정기： 표준완충액 pH 4, pH 7, pH 10으로 표준화 시킨 것

㉯ 시약

Ⓐ 에탄올용액

① 85%용액-95%에탄올 895㎖에 물을 가하여 1,000㎖로 한다.

② 78%용액-95%에탄올 821㎖에 물을 가하여 1,000㎖로 한다.

Ⓑ 내열성 α-아밀라아제용액：Sigma사 Cat. No. A3306 또는 Termamyl 300L, Novo Cat, No. 361-6282 또는 이와 동등한 것

Ⓒ 프로테아제：Sigma사 Cat. No. P3910 또는 이와 동등한 것(냉장 (0～5℃)보존) MES/TRIS 완충액으로 50㎎/㎖되게 조제한다. 사용 시 조제한다.

Ⓓ 아밀로글루코시다제용액：Sigma사 Cat. No. AMG A9913 또는 이와 동등한 것(냉장 (0～5℃)보존)

Ⓔ 규조토(Diatomaceous earth)：산세척한 것(Sigma사 Celite 545 AW. No. C8656) 또는 이와 동등한 것

Ⓕ 세척용액： 액상계면활성제(International Products사의 MICRO제품 또는 이와 동등한 것), 물로 2% 용액으로 조제한다.

Ⓖ MES：2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid(Sigma사 No. M-8250 또는 이와 동등한 것)

Ⓗ TRIS： Tris(hydroxymethyl)aminomethane(Sigma사 No. T- 1503 또는 이와 동등한 것)

Ⓘ MES/TRIS 완충용액 : MES 19.52g과 TRIS 12.2g을 물 1.7ℓ에 녹이고 6N 수산화나트륨용액으로 pH 8.2로 조절한 후 물을 가하여 2ℓ로 한다. 용액의 온도가 20℃이면 pH 8.1로, 용액의 온도가 28℃이면 pH 8.3으로 조정한다.(단, 0.05M MES, 0.05M TRIS, 24℃에서 pH 8.2)

Ⓙ 염산용액(0.561N)：6N염산 93.5㎖에 물을 가하여 1,000㎖로 한다.

㉰ 시험용액의 조제 및 시험조작

시험은 두개의 검체 및 공시험을 동시에 실시한다.

시험용액의 조제： 미리 고운분말로 한 검체(지방이 10%이상인 경우 탈지하고, 당을 많이 함유한 경우 85% 에탄올용액으로 검체 1g당 10㎖씩으로 세척한다) 1.0±0.005g 2개를 취하여 (M1, M2) 400㎖의 키가 큰 비커에 취하고, 이에 MES/TRIS용액 40㎖씩을 가하여 마그네틱 교반으로 충분히 분산시킨다. 이에 내열성 α-아밀라아제용액 50㎕를 가하고 서서히 저어 혼합하고, 알루미늄박으로 뚜껑을 한 후, 95～100℃의 수욕에서 15분간 계속 교반한다.

계속해서 95℃에서 25분간 유지한다. 반응이 끝난 후 수욕조에서 꺼내어 60℃로 식히고 뚜껑을 열어 비커의 벽 또는 바닥에 내용물이 부착되어 있으면 시약스푼으로 긁어 분산시키고 물 10㎖로 스푼과 기벽을 씻는다.

각각의 비커에 프로테아제용액 100㎕씩 가하고 알루미늄박으로 뚜껑을 한 후 60±1℃에서 계속 교반하면서 30분간 항온 시킨다. 뚜껑을 제거하고 0.561N 염산용액 5㎖를 가하고 흔들어 혼합하고 60℃에서 pH를 4.0～4.7로 조정한다. 이에 아밀로글루코시다제용액 300㎕를 넣고 흔들어 섞은 후 알루미늄박으로 뚜껑을 한 후 60℃에서 30분간 교반을 유지하며 항온 시켜 시험용액으로 한다.

㉱ 총식이섬유의 정량

시험용액 각각에 60℃의 95% 에탄올 225㎖를 가한다. 에탄올과 시험용액의 용량비율은 4：1로 한다. 수욕에서 비커를 꺼내어 실온에 1시간 방치하여 침전시킨다. 미리 셀라이트를 넣어 항량시킨 유리여과기에 78% 에탄올 15㎖를 가하여 분산시킨 후 흡인여과 하여 셀라이트층이 고르게 형성되도록 한다. 이에 시험용액을 넣어 여과하고 용기의 잔류물을 78% 에탄올로 씻어 넣어 준다.

잔사는 78% 에탄올, 95% 에탄올 그리고 아세톤의 순으로 각각 15㎖씩 2회 씻는다. 아세톤이 잔류하지 않도록 충분히 흡인시킨 후 105℃의 건조기에서 하룻밤 건조시키고 데시케이터에서 1시간 항량으로 한 후 무게를 달아 여과기와 셀라이트의 무게를 뺀다.

하나의 여과기 잔사에 대하여 질소량을 측정하고 이에 6.25를 곱하여 단백질량으로 하고, 또 다른 하나의 여과기 잔사를 525℃에서 5시간 회화시킨 후 회분량을 구한다. 검체를 제외한 공시험을 하여 ㉴에 따라 총식이섬유의 함량을 구한다.

㉲ 물불용성식이섬유의 정량

미리 셀라이트를 넣어 항량시킨 유리여과기에 물 3㎖를 가하여 분산시킨 후 흡인여과 하여 셀라이트층을 고르게 한다. 이에 검액을 여과하고 잔류물은 70℃의 물 10㎖로 2회 씻는다. 여액 및 세척액은 합하여 600㎖비커에 모아 ㉳항의 수용성식이섬유 정량용으로 한다.

잔류물은 곧바로 78% 에탄올, 95% 에탄올 그리고 아세톤의 순으로 각 15㎖씩 2회 세척한다. 여과기 잔사를 ㉱ 총식이섬유의 정량의 “…105℃의 건조기에서…” 이하에 따라 시험한다.

㉳ 수용성식이섬유의 정량

앞의 ㉲항에서 얻어진 여액 및 세척액에 60℃의 95% 에탄올을 4배량 가하거나 여액을 물로 80g으로 한 후 60℃의 95% 에탄올 320㎖를 가한다. 이를 한 시간 방치하여 침전물을 형성시킨다.

이를 ㉱ 총식이섬유의 정량에 따라 시험하고 ㉴에 따라 수용성식이섬유의 함량을 구한다.

㉴ 함량계산

공시험값 B(㎎) ＝ 공시험평균잔사무게(㎎)-PB-AB

PB：공시험 단백질량(㎎)

AB：공시험 회분량(㎎)

[eqn: rm식이섬유함량(%)={검체의평균잔사무게(mg)-P-A-B}over{검체의~평균~무게(mg)}×100]

P ：단백질량(㎎)

A：회분량(㎎)

B ：공시험값(㎎)

총식이섬유함량은 ㉱ 총식이섬유의 정량에 따라 구하거나 ㉲ 물불용성식이섬유의 정량 및 ㉳ 수용성식이섬유의 정량에 따라 구하여 얻어진 값을 합하여 구할 수 있다.

② 제2법

본 시험법은 주로 수용성 섬유소를 함유한 경우에 적용한다.

㉮ 장치

고속액체크로마토그래프

㉯ 시약

Ⓐ 텀아밀용액：Novo사 No. 120L(냉장보존)

Ⓑ 프로테아제：Sigma사 No. A-3910(냉장보존)

Ⓒ 아밀로글루코시다아제：Sigma사 No. A-9913(냉장보존)

Ⓓ 글루코오스정량용시약：교화 메덱스사 제품 데타미나-GL-E

Ⓔ 이온교환수지：Amberlite IRA-68(OH형), Amberlite 200(H형)

㉰ 시험용액의 조제

Ⓐ 효소처리액의 조제

시료 1g(필요한 경우 에테르 등으로 탈지한다)을 200㎖ 비커에 정확히 취하고 증류수 50㎖를 가하여 용해한 후, 0.1N 수산화 나트륨용액으로 pH 6.0으로 조정한다. 여기에 텀아밀용액 0.1㎖를 가하고, 알루미늄박으로 뚜껑을 하여 끓는 수욕에서 30분간 놓아둔다(5분 간격으로 교반). 실온에서 냉각 후 0.1N 수산화나트륨용액으로 pH 7.5±0.1로 조정한다. 다음 프로테아제 5㎎을 가하고 다시 알루미늄박으로 뚜껑을 해서 60℃수용액에서 30분간 진탕한다.

실온으로 냉각한 후 0.1N 염산용액으로 pH 4.5± 0.2로 조정한다. 여기에 아밀로글루코시다아제 0.1㎖를 가하고 알루미늄박으로 뚜껑을 하여 60℃ 수용액 중에서 30분간 진탕한 후 수용액 중에서 10분간 가열하여 효소를 실활 시킨다. 실온에서 냉각하고 100㎖용 메스플라스크에 옮겨 물로 정용한 액을 효소처리액으로 한다.

Ⓑ 효소처리액중의 포도당 정량

데타미나-GL-E로써 효소처리액중의 포도당량을 측정하거나 (1) 당질 ④ 기기분석법에 의한 당류의 정성 및 정량에 따라 효소처리액중의 포도당량을 구한다.

Ⓒ 시험용액의 조제

효소처리액 50㎖를 취하여 다음과 같은 조건을 갖춘 이온교환수지칼럼에 SV1.0으로 통과시켜 탈염한 후 칼럼용출액 200㎖를 감압농축하여 20㎖용 메스플라스크에 옮기고 정용한다. 이 액을 0.20μm의 멤브레인 필터로 여과한 것을 시험용액으로 한다.

주：SV 1.0은 공간속도로 충전제부피(cm3)로 시간단위당 용출액을 나누어 준 값

[탈염조건]

- 이온교환수지 Amberlite IRA-68(OH형) Amberlite-200(H형)을 1：1의 비율로 혼합한 것

- 칼럼크기： 유리관, 20㎜×300㎜

- 용리액：물

- 수지량：50㎖

㉱ 시험조작

Ⓐ 고속액체크로마토그래피 조건

㉠ 검출기：시차굴절계(RI)

㉡ 칼럼： 길이 300㎜, 안지름 8.0㎜ MCL-GEL CK 08 EC 스텐레스스틸관 상당품

㉢ 이동상： 물

㉣ 유속：0.4㎖/min

Ⓑ 정량시험

㉰ Ⓑ에 의하여 측정된 효소처리액 중의 포도당중량의 ㉰ Ⓒ의 시험용액 20㎕를 주입하여 얻은 포도당과 난소화부의 머무름 시간과 피크 면적을 이용하여 다음 식으로 효소처리액중의 난소화부 중량을 구한다.

[eqn: rm난소화부~중량(mg)={난소화부의~피크면적}over{포도당의~피크면적}×{포도당중량(mg)}]

그리고 다음 식에 의거 시료 중의 난소화부 함량(식이섬유소)을 산출한다.

[eqn: rm난소화부~중량(%)={난소화부~중량(mg)}over{시료~채취량(mg)}×100]

2. 보존료시험법

1) 데히드로초산, 소르빈산, 안식향산, 파라옥시안식향산 및 그 염류

(1) 박층크로마토그래피에 의한 정성

① 시험용액의 조제

액체검체는 10～20㎖, 고체검체는 분말로 한 다음 10～20g(알코올을 함유한 검체는 1% 수산화나트륨용액으로 pH 약 7～7.5로 한 다음 가열하여 알코올을 제거한다)을 취하여, 물을 적당량 넣고 이를 15% 주석산용액으로 산성(pH 약 2)으로 한 후 염화나트륨 30g을 가한다. 이를 수증기 증류하여 유액 100㎖를 받는다(유출속도는 1분간 약 10㎖).

유액을 10% 수산화나트륨용액으로 알칼리성으로 하여 에테르 30㎖로써 중성물질을 추출제거하고 물층은 10% 염산으로 산성으로 하여 에테르 30㎖로 추출한다. 다시 에테르층을 물 5㎖씩으로 3회 씻고, 에테르층을 분취해서 무수황산나트륨을 넣어 약 15분간 방치한다. 이를 여과하여 에테르를 감압하에서(20～30℃) 농축하고, 잔류물을 에탄올 0.1～0.3㎖에 녹여 시험용액으로 한다.

② 박층의 조제

폴리아마이드 또는 실리카겔G(박층크로마토그래피용)에 이소프로판올 또는 물을 가하여 잘 섞어서 호상(풀모양)으로 하여 일반적인 방법에 따라 0.25㎜의 박층을 만들고 이를 바람에 말린 다음 60～70℃(실리카겔은 110℃)에서 30분간 건조하여 사용한다.

③ 시험조작

박층에 시험용액 및 각 보존료표준용액을 0.2～1㎕를 약 10㎜간격으로 찍어서 전개용매 ㉮～㉰를 사용하여 전개한다. 바람에 말려 자외선 아래서 확인한 다음 발색시약 ㉮～㉱를 선택 분무하여 정색시킨다. 단, 발색시약 ㉰는 재차 10% 수산화나트륨용액을 분무하여 정색시킨다.

[전개용매]

㉮ 헥산：초산(20：0.7)

㉯ 벤젠：초산(20 : 0.5)

㉰ 벤젠：메탄올：초산(20：0.2：0.5 또는 20：0.5：0.3)

[발색시약]

㉮ 2% 황산제이철용액

㉯ 0.1% 브롬크레졸그린‧에탄올용액

㉰ 디아조설파닐산용액：설파닐산 1g에 염산 8㎖를 가하여 가열하여 녹인다. 여기에 물 100㎖를 넣는다. 이 용액에 동량의 0.7% 아질산나트륨용액을 가한다.

㉱ 0.05% 로다민 B 메탄올용액

(2) 자외선흡수스펙트럼에 의한 정량

① 시험용액의 조제

액체검체： 보존료의 함량에 따라 검체 30～100g을 비커에 취하여 10% 수산화나트륨용액 또는 10% 염산으로 중화하고 이를 500㎖～1ℓ의 환저플라스크에 옮기고 이에 15% 주석산용액 5㎖, 염화나트륨 약 80g 및 실리콘수지 한 방울을 가한 후, 전량을 물로 150～200㎖로 한다. 이를 수증기 증류기에 연결하여 증류하고 유액은 매분 약 10㎖의 속도로 하여 500㎖를 취하여 시험용액으로 한다.

고체검체： 검체를 잘게 썰거나 갈아서 보존료의 함량에 따라 30～100g을 취하여 물 50～100㎖를 가하여 잘 섞은 후 이하 액체검체와 동일하게 처리하여 시험용액으로 한다.

② 시험법

㉮ 안식향산‧소르빈산‧데히드로초산

시험용액 및 각 보존료의 표준용액 각 50㎖를 각각 분액깔때기에 취하여 이에 10%염산 4㎖, 염화나트륨 10g을 가하여 에테르 40, 30 및 30㎖로 3회 추출한다. 에테르추출액을 모두 합쳐서 소량의 물로 2회 씻고, 씻은 액은 버린 다음 에테르추출액에 1% 탄산수소나트륨용액 20㎖를 가하여 흔들어 섞고 물층과 에테르층으로 분리한다. 다시 이 조작을 1회 되풀이하여 물층을 모두 합쳐 이를 에테르 15㎖로 씻고 에테르층은 먼저 분리한 에테르층에 합친다.

물층은 수욕 상에서 에테르를 날려 보낸 후, 10% 염산으로 중화하고 물을 가하여 전량을 50㎖로 한다. 이들의 각 10㎖를 메스플라스크에 취하고 각각의 완충액(2M 염화칼륨용액 50㎖와 2N 염산 10.6㎖를 혼합하고 물을 가하여 200㎖로 한다. pH 0.6) 2㎖와 물을 가하여 20㎖로 하고 잘 흔들어 섞은 후 액층 10㎜에서 각 보존료의 측정파장인 230㎚, 265㎚ 또는 308㎚ 부근의 각 극대파장에서 흡광도를 측정하고 검액에서 얻은 흡광도를 A(230), A(265) 또는 A(308)로 하고 표준용액에서 얻은 흡광도를 As(230), As(265) 또는 As(308)로 한다.

대조액은 완충액 1에 물 9를 혼합한 것을 쓴다. 검체 중 보존료가 단독으로 존재할 때의 각 보존료의 함량(g/㎏)은 다음 식에 따라 구한다.

[eqn: rm안식향산(g/kg)=10×{A(230)}over{As(230)}×{1}over{2}×{1}over{검체채취량(g)}]

[eqn: rm소르빈산(g/kg)=5×{A(265)}over{As(265)}×{1}over{2}×{1}over{검체채취량(g)}]

[eqn: rm데히드로초산(g/kg)=20×{A(308)}over{As(308)}×{1}over{2}×{1}over{검체채취량(g)}]

㉯ 파라옥시안식향산에스테르류

시험용액 50㎖에 대하여 전항 ㉮와 같이 조작해서 얻은 에테르층을 플라스크에 옮기고, 소량의 에테르로 분액깔때기를 잘 씻고, 씻은 액은 플라스크의 액에 합쳐 수욕 상에서 에테르가 약 10㎖로 될 때까지 증발시키고 이를 50㎖의 플라스크에 옮겨 증발 시에 사용한 플라스크를 수회 소량의 에테르로 잘 씻고, 씻은 액을 먼저의 에테르액과 합쳐 수욕 상에서 에테르를 증발시켜 약 5㎖로 하고 공기를 통하여 에테르를 날려 보내고 잔류물에 10% 수산화나트륨용액 2㎖, 물 3㎖ 및 비등석 수개를 넣고, 환류냉각기를 붙여 15분간 끓인 후 식힌다. 여기서 얻은 분해액을 분액깔때기에 옮기고 소량의 물로 플라스크를 잘 씻고, 씻은 액을 분액깔때기의 액에 합쳐 물을 가하여 전량을 50㎖로 한다.

한편 따로 분액깔때기에 파라옥시안식향산 표준액 50㎖를 취하고 각각 10% 염산 5㎖ 및 염화나트륨 5g을 가하여 에테르 20㎖로 1회, 다시 각 15㎖로 2회 흔들어 섞어 추출하고 에테르추출액을 분액깔때기 중에 합쳐서 에테르액을 소량의 물로 씻은 후 1% 탄산수소나트륨용액 각 10㎖로 2회 흔들어 섞어 씻고, 씻은 액은 먼저의 물층에 합친다. 계속해서 이 물층을 분액깔때기 중에서 에테르 15㎖를 가하여 흔들어 씻고 물층을 비커에 취하고 에테르층을 버린다. 물층을 수욕 상에서 에테르를 날려 보내고 10% 염산으로 중화하고 물로 전량을 50㎖로 한다.

이들의 각 10㎖를 메스플라스크에 취하고 각각에 완충액 2㎖ 및 물을 가하여 20㎖로 하고 잘 흔들어 섞은 후 액층 10㎜에서 측정파장인 255㎚ 부근의 극대파장에서 흡광도를 측정하고 시험용액에서 얻은 흡광도를 A(255)로 하고 표준용액에서 얻은 흡광도를 As(255)로 한다. 대조액은 완충액 1에 물 9를 혼합한 것을 쓴다. 검체중의 보존료의 함량(g/㎏)은 다음 식에 따라 구한다.

[eqn: rm파라옥시안식향산(g/kg)=10×{A(255)}over{As(255)}×{1}over{2}×{1}over{검체채취량(g)}]

㉰ 안식향산과 기타 보존료가 공존하고 있을 때의 안식향산

시험용액 및 안식향산표준용액 각 100㎖를 각각 분액깔때기에 취하고 10% 염산 5㎖ 및 에테르 60㎖를 가하여 흔들어 섞어 추출한다. 다시 에테르 50㎖씩 2회 동일하게 추출하고 전 에테르 추출액을 합쳐서 에테르를 수거한 후 잔류물을 1N 수산화나트륨액 30㎖에 녹이고 45℃의 수욕중에서 5% 과망간산칼륨용액으로 적자색이 남을 때까지 흔들어 섞으면서 적가하고 다시 15～20분간 가열한다. 이때 과망간산칼륨의 색이 없어지면 다시 추가한다. 다음에 10% 염산을 가하여 명확히 산성으로 한 후, 포화아황산나트륨용액을 가하여 탈색한다. 이에 염화나트륨 10g 및 에테르 30㎖를 가하여 흔들어 섞어 추출한다. 다시 에테르 20㎖씩으로 2회 동일하게 추출하여 에테르추출액을 합치고 소량의 물로 2회 씻어, 씻은 액은 버린다. 다음에 추출액에 1% 탄산수소나트륨용액 10㎖를 가하여 흔들어 섞어 추출한다. 다시 이 조작을 1회 반복하여 물층은 모두 합쳐 수욕 상에서 에테르를 날려 보낸 후 10% 염산으로 중화하고 물을 가하여 전량을 25㎖로 한다.

이들의 각 10㎖를 메스플라스크에 취하고 각각 완충액 2㎖ 및 물을 가하여 20㎖로 하여 잘 흔들어 섞은 후 액층 10㎜에서 측정파장인 230㎚부근의 극대파장에서의 흡광도를 측정하고 시험용액으로 얻은 흡광도를 A(230)로 하고 표준용액에서 얻은 흡광도를 As(230)로 한다. 대조액은 완충액 1에 물 9를 혼합한 것을 쓴다. 검체 중의 함량(g/㎏)은 다음 식에 따라 구한다.

[eqn: rm안식향산(g/kg)=10×{A(230)}over{As(230)}× {2}×{1}over{검체채취량(g)}]

(3) 가스크로마토그래피에 의한 정성 및 정량

① 시약

㉮ 내부표준물질용액：0.1% 아세트아닐라이드의 아세톤용액

㉯ 보존료표준용액： 각 보존료 표준품을 내부표준물질 용액에 녹  여 0.5～1.0㎎/㎖의 용액을 만든다.

㉰ 고정상담체： 크로모솔브 W(60～80메쉬)

㉱ 칼럼충전제： 고정상담체에 Ⓐ 디에칠렌글리콜석시네이트폴리에스텔(DEGS)을 2～5% 및 인산을 1% 입힌다(Coating). Ⓑ 네오펜틸글리콜석시네이트폴리에스텔(NPGS)을 10% 및 인산을 1% 입힌다.

② 장치

㉮ 수소염이온화 검출기(FID)

㉯ 구테루나다니쉬 농축기

㉰ 칼럼： 길이 1～2m, 안지름 3～4㎜ 스테인레스스틸관

③ 시험용액의 조제

(2) 자외선흡수스펙트럼에 의한 정량 ① 시험용액의 조제에 따라 수증기 증류한 유액 일정량(각 보존료 5～10㎎ 함유량)을 분액깔때기에 넣고 염화나트륨 10g, 10% 염산 5㎖를 가하여 에테르 40, 30 및 30㎖씩으로 3회 추출한다. 에테르추출액을 합하여 소량의 물로 씻고 에테르층을 분취한다. 여기에 무수황산나트륨을 넣고 잠시 방치한 다음 구테루나다니쉬 농축기에서 에테르를 제거한다. 잔류물에 내부표준물질이 1㎖ 중에 1.0㎎을 함유하도록 첨가하여 아세톤으로 일정량으로 하여 시험용액으로 한다.

(가스크로마토그래피의 측정조건의 예)

㉮ 주입부온도：210～230℃

㉯ 칼럼온도：140～200℃

㉰ 검출기온도：230～250℃

㉱ 캐리어가스 및 유량： 질소 60㎖/min

④ 시험조작

시험용액 및 해당하는 표준용액 각각 1～5㎕를 앞의 조건에 따라 가스크로마토그래프에 주입한다. 얻어진 피크의 머무름시간(Retention time)을 비교해서 정성을 하고 또 얻어진 피크의 높이 또는 면적으로 검량선을 작성하여 시험용액 중의 각 보존료의 함량을 정량한다.

2) 프로피온산 및 그 염류

(1) 가스크로마토그래피에 의한 정성 및 정량

① 장치

㉮ 가스크로마토그래프 : 수소염이온화검출기(FID)

㉯ 이온교환수지칼럼 : 유리관(10㎜×10～15㎝)에 높이 25～30㎜로 충전한다.

② 시약

㉮ 강산성 이온교환수지：100～200메쉬의 도웩스(Dowex) 50X8 또는 암버라이트(Amberlite) CG120을 H형으로 하고 물로 씻는다.

㉯ 내부표준물질용액：1% 트란스-크로톤산 용액(사용 시 조제)

㉰ 프로피온산표준용액： 프로피온산 0.1g을 달아 내부표준물질용액 10㎖에 녹이고 물을 가하여 10㎖로 한다(사용 시 조제).

프로피온산표준용액1㎖＝1.0㎎ C3H6O2

③ 시험용액의 조제

잘게 자른 검체 30～50g(프로피온산으로서 100～200㎎)을 1ℓ 증류플라스크에 넣고 물 200㎖, 염화나트륨 80g, 10%인산용액 10㎖ 및 실리콘수지 한 방울을 가한 다음 수증기 증류를 하여 유액 500㎖를 받는다. 이 때 수기는 1% NaOH 20㎖를 가해 냉각기 끝이 잠기도록 한다. 유액 25㎖를 정확히 취하여 감압하에서 농축 건조한 다음 잔류물을 물 1㎖로 녹여 이온교환수지칼럼의 상부에 넣고 유출액은 내부표준물질용액 1.0㎖를 넣은 10㎖메스플라스크에 받는다. 물 1㎖씩으로 잔류물을 녹여서 이 조작을 되풀이 하여 유출액의 전량을 10㎖로 한 다음 인산 1㎖, 에틸에테르 5㎖를 가하여 흔들어 섞어 추출한다. 다시 물층을 에틸에테르로 1～2회 추출하고 에틸에테르층을 모두 합쳐 일정량으로 하여 시험용액으로 한다.

④ 가스크로마토그래프의 측정조건

㉮ 충전칼럼(Packed column)

Ⓐ 고정상 : 가스크로마토그래프용 크로모솔브 101(80～100메쉬) 또는 이와 동등한 것

Ⓑ 칼럼 :  길이 1～3m, 안지름 3～4㎜ 유리관 또는 스테인레스스틸관

㉯ 캐필라리칼럼

Ⓐ 고정상 : Polyethylene glycol-terephthalic acid 또는 이와 동등한 것

Ⓑ 칼럼 : 0.2～0.32 또는 0.53㎜의 안지름을 가지는 30m의 규산질 유리제 캐필라리에 적합한 고정상액을 화학적 결합시키거나 또는 Cross link 코팅한 것 (HP-FFAP 또는 이와 동등한 것)

㉰ 시험용액 주입부 및 검출기의 온도 : 각각 200～240℃, 200～250℃

㉱ 칼럼온도 : 160～200℃

㉲ 캐리어가스 및 유량 : 질소 또는 헬륨을 적절하게 조절한다.

㉳ 검출기의 가스유량 : 수소와 공기를 적절히 조절한다.

⑤ 시험조작

시험용액 1～5㎕를 가스크로마토그래프칼럼에 주입하고 얻어진 머무름시간(Retention time)과 프로피온산표준용액의 피크와 비교해서 정성을 하고 또 내부표준법에 따라 정량을 한다.

3) 소르빈산, 안식향산 및 그 염류

(1) 고속액체크로마토그래피에 의한 정성 및 정량

① 시약

㉮ 이동상 메탄올：50mM인산완충액(pH 5.0)[40：60]

㉯ 표준용액： 소르빈산, 안식향산 20㎎을 물에 녹여 250㎖로 한다. 사용할 때 이 액을 적당량 취하여 메탄올로 희석한다.

㉰ 0.005M CTA용액

25% Cetyltrimethylammonium chloride 용액을 희석하여 조제한다.

② 장치

㉮ 검출기∶자외부검출기(UV), 230㎚

㉯ 칼럼∶Spheri-5 ODS 또는 그와 동등한 것

㉰ 용매여과기∶Solvent Clarification Kit나 그와 동등한 것

③ 시험용액의 조제

시료 5g을 취하여 물로 25㎖가 되게 희석한 후 이 액 5㎖를 취해 1N 염산 0.5㎖와 0.005M CTA용액 0.5㎖를 가하여 섞어준 후 메탄올 10㎖, 물 10㎖, 0.005M CTA용액 10㎖로 차례로 흘려 씻어준 Sep-Pak C18ⓡ 카트리지에 시험용액을 2㎖/min의 속도로 가한다. 이어서 물 10㎖로 카트리지를 씻고 메탄올 10㎖로 용출시켜 전량을 메탄올로 10㎖가 되게 한다. 이 액을 0.45㎛의 여지로 여과하여 시험용액으로 한다.

④ 시험조작(고속액체크로마토그래피의 측정조건의 예)

- 유속∶0.8～1.2㎖/min

- 시험용액 주입량∶10～20㎕

- 감도∶0.05AUFS

시험용액 및 표준용액 10～20㎕를 앞의 조건에 따라 고속액체크로마토그래피 칼럼에 주입하고, 얻어진 피크의 높이 또는 면적으로 다음 식에 따라 검체중의 소르빈산 및 안식향산의 양을 산출한다.

[계산식]

[eqn: rm보존료(g/kg)=각~표준용액의 농도(mg/kg)×{PA}over{PS}×{50}over{SA}×{1}over{1,000}]

PS: 표준용액의 높이 또는 면적

PA : 시험용액의 높이 또는 면적

SA : 검체의 무게(g)

3. 산화방지제시험법

1) 부틸히드록시아니졸(BHA), 디부틸히드록시톨루엔(BHT)

(1) 가스크로마토그래피에 의한 정성 및 정량

① 시약

㉮ 내부표준물질용액：후루오렌 또는 벤조페논 50㎎을 디클로로메탄에 녹여 100㎖로 한다.

㉯ 표준용액：BHA, BHT 각 50㎎을 디클로로메탄에 녹여 100㎖로 한다. 사용 시 이 액 10㎖와 내부표준물질용액 10㎖를 취하여 디클로로메탄으로 50㎖로 한다.

㉰ 칼럼충전제：60～80메쉬의 규조토(크로모솔브 W, 가스크롬 Q등)에 OV 17(5%) 또는 SE-30(5～10%)을 각각 입힌다.

② 장치

㉮ 수소염이온화 검출기(FID)

㉯ 칼럼： 길이 2m, 안지름 3～4㎜, 스테인레스스틸관 또는 유리관

㉰ 구테루나다니쉬 농축기

③ 시험용액의 조제

㉮ 유지(액상식물유)

검체 5g을 달아 펜탄 20㎖에 녹인 다음 n-펜탄포화아세트니트릴 100㎖로 4회 추출한다. 추출액은 합쳐서 구테루나다니쉬 농축기로 용매가 1～2㎖ 남을 때까지 농축한 다음 내부표준물질 1.0㎖와 디클로로메탄을 가하여 전량을 5.0㎖로 하여 시험용액으로 한다.

<가스크로마토그래피 측정조건의 예>

- 주입부온도：200℃

- 칼럼온도：150～180℃

- 검출기온도：180～210℃

- 캐리어가스 및 유량：N2, 30～60㎖/min

④ 시험조작

시험용액 및 표준용액에 대하여 2. 보존료시험법 2) 프로피오산 및 그 염류 (1)의 ④에 따라 시험한다.

2) 몰식자산프로필

(1) 정성시험

검체 약 30g을 비커에 취해(필요시 약간 가온한다) 석유에테르 약 60㎖에 녹여 분액깔때기에 옮기고 물 15㎖를 가하여 1분간 진탕한 후 물층을 다른 분액깔때기에 취한다. 석유에테르층은 물 15㎖로 2회 같은 조작을 하고 물층을 합한 다음 물층에 에테르 15㎖를 가한다. 1분간 진탕하고 에테르층을 비커에 취하여 증발 건조시킨 후 잔류물에 50% 알코올용액 4㎖를 가하여 잘 섞고 암모니아수 1㎖를 가한다. 이 때 적색을 띠면 몰식자산 프로필이 존재한다(변색이 불안정하므로 수분 후에 사라진다).

(2) 정량시험

① 시약

㉮ 석유에테르

증류범위 30～60℃의 석유에테르 1용량과 증류범위 60～100℃의 석유에테르 3용량을 잘 섞은 후 그 양의 1/10량만큼의 황산을 가해 5분간 진탕한 후 방치하고, 산층은 버리고 석유에테르층을 취해 물로 여러 번 씻어낸 후, 1% 암모니아수로 한번 씻은 다음 알칼리층은 버리고 석유에테르층을 취해 물로 중성이 나타날 때까지 씻어 증류 정제한다.

㉯ 초산암모늄용액

1.25, 1.67 및 10% 초산암모늄수용액을 만들고 필요시 5% 알코올용액으로 1.67% 초산암모늄용액도 만든다.

㉰ 주석산제1철용액

황산제1철 0.100g 및 주석산칼륨나트륨 0.500g을 물에 녹여 100㎖로 한다. 조제 후 3시간 안에 사용해야 한다.

㉱ 몰식자산프로필표준용액：50㎎의 몰식자산프로필을 물에 녹여 1ℓ로 한다(50㎍/㎖).

② 시험용액의 조제

검체 약 40g을 정밀히 달아 석유에테르에 녹여 250㎖가 되게 한 다음 그 중 100㎖를 분액깔때기에 취하고 1.67% 초산암모늄용액 20㎖씩으로 3회 추출하여 물층은 100㎖ 메스플라스크에 합한다. 석유에테르층은 물 15㎖를 가하고 30초간 진탕한 후 물층을 다시 합하여 10% 초산암모늄용액 2.5㎖를 가하고 물로 100㎖가 되게 한 다음 여과하여 시험용액으로 한다(유화가 심한 검체는 추출 전에 N-옥탄올 2㎖를 가하여 5% 알코올용액을 사용하여 만든 1.67% 초산암모늄용액으로 추출한다).

③ 시험조작

시험용액은 20㎖이하, 대조액은 1.25% 초산암모늄용액 20㎖를 각각 25㎖ 메스플라스크에 취하여 주석산 제1철용액 1㎖를 가하고 물로 채워 잘 흔들어 섞은 후 3분 안에 540㎚에서 흡광도를 측정하여 검량선으로부터 몰식자산프로필양을 계산한다. 따로 몰식자산프로필 표준용액 1, 2, 4, 6, 8㎖를 25㎖메스플라스크에 취해 물로 약 17.5㎖가 되도록 가하고 검체와 동일하게 처리하여 검량선을 작성한다.

3) 이.디.티.에이.이나트륨, 이.디.티.에이.칼슘이나트륨

(1) 고속액체크로마토그래피에 의한 정성 및 정량

① 시약 및 시액

㉮ 이동상 : 0.01M TBA-OH용액 : 에탄올(19:1)

㉯ 0.01M TBA-OH용액 : 40% TBA-OH(Tetrabutylammonium hydroxide)용액 6.5㎖에 물 900㎖를 가하고 초산으로 pH 3.0으로 조정한 다음 물을 가하여 1,000㎖로 한다.

㉰ 표준원액 : 이. 디. 티. 에이. 이나트륨(2수화물) 약 110.7㎎을 정밀히 달아 물을 가하여 100㎖로 한다.

㉱ 0.01M 염화제이철용액 : 염화제이철(FeCl3․6H2O) 0.27g을 0.01N 염산에 녹여 100㎖로 한다.

② 장치

㉮ 검출기 : 자외부검출기(UV), 255㎚

㉯ 칼럼 : Zorbax ODS 또는 이와 동등한 것

㉰ 용매여과기 : Solvent Clarification Kit 또는 이와 동등한 것

③ 시험용액의 조제

액상검체는 약20g을 취하고, 고체검체는 잘 갈은 후 약 20g을 취하고 물 40㎖ 및 염화메틸렌 40㎖를 가하여 진탕 혼합한 다음 6,000rpm, 15분간 원심 분리한다. 물층을 100㎖ 플라스크에 취하고 잔류물에 물 40㎖를 가하여 진탕 혼합한 다음 다시 원심 분리한다. 물층을 합하고 물을 가하여 100㎖로 한 후 여과한다(통조림제품의 경우 물 추출액에 10% 황산아연용액 6㎖와 페놀프탈레인시액 2방울을 가한 다음 엷은 적색이 나타날 때까지 1% 수산화나트륨용액을 가한 후 물로 100㎖되게 한 후 여과한다). 여액 25㎖를 취하여 회전농축기를 이용하여 증발 농축한 다음 잔류물을 0.01M 염화제이철용액 5㎖로 녹이고 물을 가하여 10㎖로 한 후 멤브레인필터로 여과하여 시험용액으로 한다. 따로 표준원액 0.1～0.5㎖에 0.01M 염화제이철용액 5㎖를 넣은 다음 물을 가하여 10㎖로 하여 멤브레인필터로 여과하여 표준용액으로 한다.

④ 시험조작(고속액체크로마토그래피의 측정조건의 예)

- 유속 : 1.0㎖/min

- 주입량 : 10～20㎕

시험용액 및 표준용액을 고속액체크로마토그래프칼럼에 주입한다. 얻어진 피크의 머무름 시간(Retention time)을 비교해서 정성을 하고, 또한 얻어진 피크의 높이 또는 면적으로 검량선을 작성하여 시험용액중 이.디.티.에이.이나트륨의 함량을 정량한다.

4) 부틸히드록시아니졸(BHA), 디부틸히드록시톨루엔(BHT), 터셔리부틸히드로퀴논(TBHQ) 및 몰식자산프로필[PG]

(1) 액체크로마토그래피에 의한 정성 및 정량

① 시약

㉮ 이동상：물：아세토니트릴：초산[35：60：5]

㉯ 표준용액

BHA, TBHQ 각 50㎎과 PG 25㎎, BHT 100㎎을 이소프로판올 및 아세토니트릴혼액 [1：1]에 녹여 50㎖로 한다. 사용 시 이액 10㎖를 취하여 위의 혼합액으로 100㎖로 한다.

② 장치

㉮ 검출기：자외부검출기(UV), 280㎚

㉯ 칼럼：μ-Bondapak C18 또는 Lichrosorb RP-18

㉰ 용매여과기

Solvent Clarification Kit나 그와 동등한 것.

③ 시험용액의 조제

㉮ 유지(액상식물유)

균질화한 검체 5g을 비커에 달아, 5㎖ 헥산이 들어 있는 125㎖ 분액깔때기에 옮기고, 헥산 15㎖로 여러 번 나누어서 비커를 씻어 분액깔때기에 합친다. 여기에 헥산포화아세토니트릴 50㎖씩으로 3회 추출하고(만약 유탁형태가 일어나면 뜨거운 물에 분액깔때기를 5～10초 동안 담가서 분리한다), 추출액을 250㎖ 분액깔때기에 합한다. 이 액을 농축수기에 서서히 옮겨 40℃이하의 수욕에서 회전농축기를 사용하여 3～4㎖로 농축하여 눈금이 있는 용기에 옮기고 씻어 전량을 5㎖로 한 후, 이소프로판올 5㎖로 수기를 씻어 전량을 10㎖로 하여 시험용액으로 한다.

④ 시험조작(액체크로마토그래피의 측정조건의 예)

- 유  속：1.0～1.5㎖/min

- 시험용액주입량：10～20㎕

- 감도：0.05AUFS

시험용액 및 표준용액 10～20㎕를 앞의 조건에 따라, 액체크로마토그래프칼럼에 주입하고, 얻어진 피크의 높이 또는 면적으로 다음 식에 따라 검체 중의 BHA, BHT, TBHQ 및 PG의 양을 산출한다.

[계산식]

[eqn: rm산화방지제(mg/kg)=각~표준용액의 농도(mg/kg)×{PA}over{PS}×{50}over{SA(g)}]

PS ：표준용액의 높이 또는 면적

PA：시험용액의 높이 또는 면적

4. 착색료시험법

1) 타르색소(산성색소)

(1) 모사염색법에 의한 분리‧정성법

① 시약

㉮ 탈지양모

Ⓐ 법： 백색양모 100g을 강암모니아수 1～4㎖를 적당히 물로 희석한 용액 중에 담그고 가끔 저으면서 45℃에서 30～60분간 방치한 다음 건져내어 가볍게 짜고 다음에 희석한 암모니아수(1→100)에 잠시 방치하였다가 건져내어 처음에는 온탕, 다음에는 냉수로 씻고 가볍게 짜서 바람에 말린다.

Ⓑ 법： 속시레추출기에서 석유 에테르로 백색양모를 충분히 탈지한 다음 에테르를 실온에서 증발시켜 물로 충분히 씻고 가볍게 짜서 바람에 말린다.

㉯ 실리카겔(5% 황산칼슘을 함유한 것) 또는 폴리아마이드

2. 보존료시험법 1)의 (1), ② 박층의 조제에 따라 만든다.

② 시험용액의 조제

㉮ 추출： 다음의 한 방법에 따라 색소추출액을 만든다.

Ⓐ 액상검체

착색의 정도에 따라 검체 20～200㎖를 취하여 적당히 물을 가하여 시험용액으로 한다. 알코올을 함유한 것은 중화한 다음 수욕 상에서 알코올을 증발시키고 물을 보충하여 색소추출액으로 한다.

Ⓑ 고상검체

착색의 정도에 따라 검체 20～200g를 취하여 가능한 한 작게 부수고 다음의 한 방법에 따라 색소추출액을 만든다.

㉠ 검체에 약 5배량의 온탕을 가하여 잘 저어 녹여 색소추출액으로 한다.

㉡ 검체에 약 3～5배량의 온탕을 가하여 잘 저은 다음 잠시 두었다가 유리솜 또는 석면으로 여과하든가 원심분리하여 고형물을 제거하여 색소추출액으로 한다. 이 방법으로 색소가 추출되지 않을 때에는 ㉢에 따라 만든다.

㉢ 검체에 80v/v% 에탄올을 약 4～5배량 가하여 가끔 흔들어 섞으면서 2～3시간 방치하고 상징액을 취하여 약 1% 암모니아수를 함유한 70v/v% 에탄올로 되풀이 하여 추출한다. 상징액은 앞의 상징액에 합치고 6% 초산으로 중화한 다음 끓여 에탄올을 증발시키고 물을 가하여 색소추출액으로 한다. 검체가 아직 현저하게 착색되어 있을 때에는 1% 초산을 함유한 70v/v% 에탄올로 되풀이하여 추출하여 상징액을 취하여 10% 암모니아수로 중화하고 끓여 에탄올을 증발시키고 물을 가하여 색소추출액으로 한다.

㉣ 검체를 큰 여과지나 비커에 취하여 에테르로 몇 번 씻어 탈지하고 에테르를 실온에서 날려 보낸 다음 앞의 ㉡, ㉢에 따른다.

㉤ 검체에 80v/v% 에탄올을 약 5배가량 가하여 가끔 흔들어 섞으면서 24시간 방치하고 상징액을 취하여 수욕 상에서 1/5로 농축하고 약 1/4용량의 25% 염화나트륨용액과 약간 과량의 10%암모니아수를 가하여 분액깔때기에 옮겨 같은 양의 석유에테르로 몇 번 탈지한 다음 아래층의 알칼리액을 6% 초산으로 중화하여 색소추출액으로 한다.

㉥ 검체에 약 5배가량의 물을 가하여 끓이고 물층이 착색하면 식힌 다음 수용액을 취하여 색소추출액으로 한다.

㉯ 정제

색소추출액 5㎖에 1% 초산 1㎖를 가하고 탈지양모 0.1g을 넣고 잘 흔들어 섞은 다음 수욕중에서 30분간 가온한 다음 양모를 건져내어, 양모가 염색되지 않으면 불검출로 하고 양모가 염색되면 이 염색된 양모를 1% 암모니아용액 5㎖ 중에 넣고 30분간 가온한 다음 양모를 건져내고 초산으로 중화하고 약 1%의 농도로 조제하여 시험용액으로 한다.

③ 시험조작

㉮ 여지크로마토그래피

크로마토그래피용 여과지의 끝에서 40㎜의 곳에 연필로 줄을 긋고 그 위에 시험용액과 색소표준용액을 각각 20㎜의 간격으로 미량 피펫 또는 모세관으로 직경 약 5㎜의 원이 되게 찍고 말린다. 이 여과지를 규정의 전개용매를 넣은 용기에 여과지가 기벽에 닿지 않도록 주의하여 수직으로 매달고 하단 약 10㎜를 전개용매 중에 담가 뚜껑을 닫아 방치한다. 용매가 반점에서 13～25㎝의 높이까지 상승하였을 때 여과지를 건져내어 말린 다음, 시험용액과 색소표준용액으로부터 전개된 반점의 위치와 색을 처음에 자연광, 다음에 자외선(약 365㎚)에서 비교 관찰한다.

<전개용매>

Ⓐ 아세톤： 이소아밀알코올： 물(6：5：5)

Ⓑ n-부탄올 무수에탄올：1% 암모니아수(6：2：3)

Ⓒ 25% 에탄올용액：5% 암모니아수(1：1)

㉯ 박층크로마토그래피

실리카겔 또는 폴리아마이드 박층의 하단에서 2㎝의 일직선상에 시험용액 및 색소표준용액을 직경 약 3㎜로 1㎝의 간격으로 찍고 말린다. 이를 박층의 하단 0.5～1㎝를 전개용매에 담그고 8～15㎝ 전개시킨다. 전개가 끝나면 시험용액과 색소표준용액에서 얻은 반점의 위치와 색을 자연광 및 자외선(약 365㎚) 조사 하에서 비교 관찰한다.

<전개용매(실리카겔 박층)>

Ⓐ 초산에틸： 메탄올：28% 암모니아수(4.5：1：1 또는 3：1：1)

Ⓑ 아밀알코올： 에탄올：28% 암모니아수(10：10：1)

Ⓒ 메틸에틸케톤：에틸렌글리콜노메틸에테르：에탄올：28% 암모니아수 (20：15：12：1)

<전개용매(폴리아미드 박층)>

Ⓐ 메탄올： 에탄올： 이소아밀알코올：28% 암모니아수(15：10：5：3)

Ⓑ 피리딘： 메탄올：28% 암모니아수： 물(5：6：1：16)

2) 유용성색소(유용성타르색소 포함)

(1) 시험용액의 조제

① 수분이 많은 검체

검체 5～20g(착색의 정도에 따라 채취량을 증감한다)에 약 5배량의 60v/v% 에탄올을 가하여 흔들어 섞으면서 30～60분간 방치하고 상징액은 분액깔때기에 취한다.

검체가 아직 착색이 되어 있을 때에는 점차적으로 에탄올의 농도를 높여 상징액이 착색되지 않을 때까지 앞의 조작을 되풀이 한다. 상징액은 앞의 상징액에 합치고 여기에 같은 양의 물 및 석유에테르 100㎖를 가하여 추출하고 잠시 방치한 다음 석유에테르층을 분취하여 시험용액으로 한다.

② 수분이 적은 검체

검체 5～10g(착색의 정도에 따라 채취량을 증감한다)을 200㎖의 공전플라스크에 취하고 석유에테르 100㎖를 가하여 때때로 흔들면서 방치한 다음 색소를 추출하고 이 액을 여과하여 시험용액으로 한다.

(2) 시험조작

① 용제에 의한 분리법

시험용액 30㎖를 분액깔때기에 취하고 같은 양의 N, N-디메틸포름아마이드를 가하여 추출한 다음 방치한다. 아래층의 N, N-디메틸포름아마이드용액을 분취하여 석유에테르 10㎖씩으로 3회 씻고 석유에테르를 버린다. 다음 물 30㎖를 가하여 혼합하고 잠시 방치하여 식힌 다음 클로로포름 10㎖를 가하여 흔들어 섞고 잠시 방치할 때, 클로로포름층이 황색으로 착색하면 유용성색소의 존재가 추정되므로 다음의 ② 여지크로마토그래피에 의한 방법으로 시험한다.

② 여지크로마토그래피

①항에서 얻어진 클로로포름용액을 물로 씻은 다음 무수황산나트륨으로 탈수하고 저온에서 농축(약 0.1%의 농도)하여 시험용액으로 하고 크로마토그래피용 여과지(5%유동파라핀‧석유에테르 중에 30분간 담근 다음 바람에 말린 것 400×60㎜) 및 다음의 전개용매를 이용하여 이하 위의 1) 타르색소 ③ 시험조작 ㉮ 여지크로마토그래피에 따라 시험한다.

<전개용매>

㉮ 메탄올：초산：물(16：1：3)

㉯ 아세톤：물(7：3)

③ 박층크로마토그래피

②항의 시험용액으로 박층크로마토그래피용 실리카겔(100℃에서 60분간 가열하여 활성화시킨 것) 및 다음의 전개용매를 이용하여 1) 타르색소 ③ 시험조작 ㉯ 박층크로마토그래피에 따라 시험한다.

<전개용매>

㉮ 키실렌

㉯ 1, 1, 2-트리클로로에탄

㉰ n-헥산：클로로포름(6：4)

㉱ 초산이소아밀：n-헥산(15：100)

5. 유해성금속시험법

1) 시험용액의 조제

(1) 황산-질산법

이 방법은 Zn, Cd, Cr, Sn, Cu, As 등의 시험에 적합하다. 검체(건조물로서 5～20g에 상당하는 양)를 분해플라스크에 취해 물 50～70㎖, 질산 10～40㎖를 넣고 혼합하여 방치한다. 다음에 조용히 가열하여 격렬한 반응이 그치면 식힌 다음 황산 5～20㎖를 넣고 다시 조용히 가열한다. 내용물이 암색이 되기 시작하면 질산 2～3㎖씩을 추가하면서 가열을 계속하여 내용물이 미황색～무색이 되었을 때 분해가 끝난 것으로 한다. 분해액을 식힌 후 물 30～50㎖, 포화수산암모늄용액 10～25㎖를 가해서 황산의 흰 연기가 발생할 때까지 가열하고 식힌 다음 물로 일정량으로 하여 시험용액으로 한다. 공시험용액에 대해서도 같은 조작을 하여 시험용액을 보정한다.

(2) 황산-질산환류법

이 방법은 Hg의 시험에 적합하다.

검체(건조물로서 5～10g에 상당하는 양)를 분해플라스크에 취하고, 물 10㎖ 및 질산 20㎖를 넣어 혼합하여 잠시 방치한 다음 황산 20㎖를 천천히 넣는다. 환류냉각기를 연결하여 주의하면서 NO2의 발생이 끝날 때까지 가열한다. 분해액이 담황색으로 투명하게 되지 않을 때에는 식힌 다음 질산 5㎖를 넣어 다시 가열한다. 필요하면 질산 5㎖의 추가를 되풀이 하여 분해액이 담황색으로 투명하게 되고 NO2의 발생이 끝나면 식힌 다음 물 50㎖ 및 10% 요소용액 10㎖를 넣어서 10분간 끓이고 식혀 과망간산칼륨 1g을 넣고 10분간 때때로 흔들어 섞는다. 자홍색이 없어지면 다시 과망간산칼륨 1g을 넣고 흔들어 섞는다. 이 조작을 자홍색이 남을 때까지 되풀이 하고 20분간 끓여 액의 자홍색이 없어지면 식힌 다음 과망간산칼륨 1g을 넣고 다시 20분간 가열한다.

그림 5-1. 수은분해장치의 예

이 때 액의 자홍색이 없어지면 과망간산칼륨의 첨가 및 가열 조작을 다시 2회 되풀이 하고 식혀 용액이 무색투명하게 될 때까지 10% 과산화수소용액을 주의하여 적가한다. 다만, 비색의 경우에는 과산화수소 대신 20% 염산히드록실아민용액을 이용한다. 식힌 다음 장치의 내부 및 연결부분을 황산(1→100) 20㎖로 씻고 플라스크에 합쳐 일정량으로 하여 시험용액으로 한다. 지방분이 많은 검체는 헥산 20㎖씩으로 3회 추출하여 수용액을 시험용액으로 한다.

(3) 건식회화법

검체(건조물로서 5～20g에 상당하는 양)를 도가니, 백금접시에 취해 건조하여 탄화시킨 다음 450～550℃에서 회화한다. 회화가 잘 되지 않으면 일단 식혀 질산(1+1) 또는 50% 질산마그네슘용액 또는 질산알루미늄 40g 및 질산칼륨 20g을 물 100㎖에 녹인 액 2～5㎖로 적시고 건조한 다음 회화를 계속한다. 회화가 불충분할 때는 위의 조작을 1회 되풀이하고 필요하면 마지막으로 질산(1+1) 2～5㎖를 가하여 완전하게 회화를 한다. 회화가 끝나면 회분을 물로 적시고 염산 2～4㎖를 가하여 수욕상 또는 건조장치에서 건조한 다음 염산 1～2㎖ 또는 각 시험법에서 지정한 용매(원자흡광광도법에 의한 직접법의 경우 Sn은 1N 염산, 그 밖의 금속은 0.5N 질산)를 가하여 가온해서 녹이고 불용물이 있으면 석면 또는 유리여과기로 여과한 다음 일정량으로 하여 시험용액으로 한다. 다만, 회화보조제로서 염산, 산화마그네슘, 탄산나트륨등을 사용해도 좋으나 Sn의 시험에 있어서는 질산염 또는 질산을 사용해서는 아니 되며 그 밖의 금속의 경우에도 시험조작에 영향이 없을 때에만 사용하되 공시험용액에 대해서도 같은 조작을 하여 시험용액을 보정한다.

2) 측정

(1) 원자흡광광도법

이 방법은 시험용액중의 금속원소를 적당한 방법으로 해리시켜 원자 증기화하여 생성한 기저상태의 원자가 그 원자증기를 통과하는 빛으로부터 측정파장의 빛을 흡수하는 현상을 이용하여 광전측정 등에 따라 목적원소의 특정파장에 있어서 흡광도를 측정하고 시험용액중의 목적원소의 농도를 구하는 방법이다. 검체를 원자화하는 일반적인 방법은 화염방식과 무염방식이 있다.

① 직접법

이 방법에는 화염원자흡광법은 Zn, Cd, Cu, Pb, Mn, Ni, Co, Sn, Fe등을, 무염원자흡광법은 이들 9원소와 Sb, Cr, Se, Bi, As, V 및 Be등의 측정에 쓰인다.

㉮ 시험조작

시험용액 및 공시험용액을 그대로, 혹은 희석 또는 농축한 다음 원자흡광광도계에 주입하여 흡광도를 구하고 따로 표준용액 및 이의 공시험용액에 대해서도 각각 시험용액의 경우와 같은 조작을 해서 검량선을 작성하여 시험용액의 농도를 구한다.

② 용매추출법

이 방법은 Zn, Cd, Cu, Pb, Mn, Ni 및 Fe등의 측정에 쓰인다.

㉯ 시험조작

시험용액 및 공시험용액을 각각 10～50㎖ 취하여 각각에 25% 구연산암모늄용액 2～10㎖ 및 BTB시액 2방울을 가하여 액의 색이 황색에서 연한 녹색이 될 때까지 암모니아수로 중화하고 이에 40% 황산암모늄시액 2～10㎖ 및 물을 가하여 일정량으로 한다.

여기에 10% DDTC용액 2～10㎖를 넣고 혼합하여 수분간 방치한 다음 MIBK 10～20㎖를 가하여 격렬히 흔들어 섞는다.

이를 정치하여 MIBK층을 분취하여 원자흡광광도계에 주입하여 각각의 원소측정파장에 있어서 흡광도를 측정하고 따로 표준용액 및 공시험용액에 대해서도 같은 조작을 하고 검량선을 작성하여 시험용액의 농도를 구한다.

(2) ICP법

이 방법은 아르곤 가스에 고주파를 유도결합방법으로 걸어 방전되어 얻어진 아르곤 프라즈마에 시험용액을 주입하여 목적원소의 원자선 및 이온선의 발광광도를 측정하여 시험용액 중의 목적원소의 농도를 구하는 방법이다.

① 직접법

이 방법은 Pb, Cd, Cu, Zn, Mn, Ni, Co, Sn, Fe, As, Sb, Cr, Se, Bi, V, Be등의 대부분의 금속의 측정에 쓰인다.

② 시험조작

표준용액과 시험용액 및 공시험용액을 ICP에 주입하여 시험용액의 농도를 구한다.

3) 금속별 시험

(1) 비소

① 굿짜이트(Gutzeit)법

㉮ 시약

Ⓐ 염화제1주석용액

염화제1주석(SnCl2‧2H2O) 4g을 염산 125㎖에 녹이고 물을 가해서 250㎖로 하여 공전병에 보존한다. 만든 후 1개월 이내에 사용한다.

Ⓑ 아연(무비소)：약 20～30메쉬(600～850㎛)

Ⓒ 요오드칼륨용액：요오드화칼륨 16.5g을 물에 녹여 100㎖로 한다. 차광하여 보존한다.

Ⓓ 초산납유리솜：유리솜을 약 2～5㎜로 잘라 이를 초산 한 방울을 가한 물에 초산납 9.5g을 녹여 100㎖로 한 용액에 담근 다음 꺼내어 과량의 액을 제거하고 건조한다.

Ⓔ 브롬수은지

크로마토그래피용 여과지를 지름 약 18㎜의 원형으로 끊어 이를 브롬제2수은(HgBr2) 5g을 에탄올(95v/v%) 100㎖에 녹인 액에 담가 때때로 흔들어 주면서 1시간 이상 어두운 곳에 방치한 다음 여과지 위에 수평으로 얹어 자연 건조시켜 마개달린 갈색병에 보존한다. 정색하는 부분에 손을 대어서는 아니 된다.

Ⓕ 아비산표준용액

아비산(최순품)을 미세한 분말로 하여 105℃에서 4시간 건조한 다음 0.10g을 정확하게 달아 수산화나트륨용액(1→5) 5㎖에 녹인다. 이 액을 황산(1→20)으로 중화하고 다시 황산(1→20) 10㎖를 추가한 다음, 새로 끓여서 식힌 물을 넣어 1,000㎖로 하여 표준원액으로 한다.

이 표준원액 10㎖에 황산(1→20) 10㎖를 넣고 새로 끓여서 식힌 물을 넣어 1,000㎖로 한다(쓸 때 만들어 마개달린 병에 보존한다).

아비산표준용액 1㎖ ＝ 1.0μg As2O3

㉯ 장치

다음 그림 5-2와 같다(단위 ㎜).

그림 5-2.

A：발색병∶용량 약 60㎖로서 40㎖에 표선이 있다.

B：안지름 약 6.5㎜의 유리관

C 및 D：접속부가 안지름 6.5㎜, 바깥지름 약 18㎜로서 갈아 맞춘 것이며 유리관의 접속부에서 내연과 외연이 동심원으로 된 것

E：고무마개

F：유리관 B의 오목한 부분으로서 이에 유리솜을 채운다.

G：고무관

H：크립

유리관(B)에는 유리솜을 F로부터 약 30㎜ 높이까지 채우고 초산납시액 및 물을 같은 양의 혼합액으로 고르게 적시고 관의 하단으로부터 조용히 흡인하여 유리솜 및 기벽에서 과량의 액을 제거한다. 사용 직전에 C관 및 D관의 접속부에 브롬제2수은지를 끼우고 크립 H로 고정한다.

㉰ 시험조작

시험용액 25㎖이하(As2O3로서 0.2～2.0μg)를 발색병에 넣고 브롬페놀블루시액 1방울을 가하여 암모니아수로 중화한 다음 염산(1→2) 5㎖, 요오드화칼륨용액 5㎖ 및 염화제일주석용액 5㎖를 각각 넣고 10분간 방치한 다음 물을 가하여 40㎖로 한다. 이에 아연 2g을 넣고 즉시 장치를 연결하여 25℃의 물에 발색병(A)을 약 3/4까지 담가 1시간 방치한 다음 정색한 브롬수은지를 따로 아비산표준용액 0.0, 0.2, 0.5 및 1.0㎖씩을 취해 시험용액과 같은 양의 공시험용액을 넣은 다음 시험용액과 동일하게 조작한 것과 색을 비교하여 비소(As2O3)의 함량을 구한다.

② 디에틸디티오카아바민산은(Silver diethyl dithiocarbamate)법

㉮ 시약

Ⓐ 디에틸디티오카아바민산은 피리딘용액

디에틸디티오카아바민산은 1g을 피리딘(특급) 200㎖에 녹인다. 차광해서 냉암소에 보존한다.

Ⓑ 아연(무비소)：20～30메쉬의 아연을 1% 황산동 용액에 검게 될 때까지 담근 다음 물로 씻어 건조한다.

Ⓒ 염화제일주석용액, 아비산표준용액, 요오드칼륨용액 및 초산납유리솜은 ① 굿짜이트법의 시약과 같다.

㉯ 장치

그림 5-3

다음 그림 5-3과 같다(단위 ㎜).

A：발색플라스크(내용량 100～125㎖)

B：흡수관(초산납유리솜)

C：가스유도관(내경 2, 배출구 0.5)

D：흡수수기

㉰ 시험조작

시험용액 25㎖이하(As2O3로서 2～10μg)를 발색플라스크에 취하고 브롬페놀블루시액 1방울을 가하여 암모니아수로 중화한 다음 물을 가하여 25㎖로 한다. 이에 염산(1+1) 5㎖, 요오드화칼륨용액 2㎖ 및 염화제일주석용액 5㎖를 넣고 실온에서 15분간 방치한다. 흡수수기에 디에틸디티오카아바민산은 피리딘용액 3㎖를 넣는다.

발색플라스크에 아연 3g을 넣고 즉시 흡수관 및 가스유도관을 연결하고 가스유도관의 끝의 흡수수기의 밑부분에 오게 해서 기포가 작고 연속적으로 나오도록 조절한다.

다음에 20～25℃에서 1시간 방치한 다음 장치를 풀고 가스유도관의 내벽에 부착한 액을 흡수수기내의 액과 잘 섞는다. 이 흡수액을 1㎝의 흡수 Cell에 취해 30분 이내에 디에틸디티오카아바민산은 피리딘용액을 대조액으로 하여 파장 525㎚ 부근에서 흡광도를 측정한다. 따로 아비산표준용액 0.0, 2.0, 4.0, 6.0, 8.0 및 10.0㎖를 취하여 이에 시험용액과 같은 양의 공시험용액을 가해서 시험용액과 같은 조작을 한 다음 각각의 흡광도를 측정하여 작성한 검량선으로부터 비소(As2O3)의 함량을 구한다.

(2) 납

① 디티존에 의한 정량법

㉮ 시약

Ⓐ 디티존클로로포름용액

디티존 0.03g을 달아 클로로포름 100㎖에 흔들어 섞어서 녹이고 암모니아수(1→ 100) 100㎖를 가하여 잘 흔들어 섞고 물층을 분리해서 취한다. 다시 클로로포름층을 암모니아수(1→100) 100㎖씩을 2회 같은 조작을 하고 물층을 합하여 클로로포름 20㎖씩으로 3회 씻는다.

물층에 염산(1→2)을 가하여 산성으로 한 다음 클로로포름 200㎖씩으로 2회 추출한다. 클로로포름추출액을 합쳐서 클로로포름으로 전량을 약 1,000㎖로 하여 원액으로 한다. 차광해서 냉암소에 보존한다.

Ⓑ 디티존‧벤젠용액

디티존 약 1g을 클로로포름 100㎖에 녹이고 불용물이 있으면 여과한다. 이 여액을 암모니아수(1→100) 100㎖씩으로 4회 추출하여 물층을 합하여 탈지면으로 여과한다.

이 여액에 염산(1→2)을 가하여 산성으로 한 다음 침전물을 클로로포름 20㎖씩으로 2회 추출한다. 클로로포름추출액을 합하여 소량의 물로 2～3회 씻고 비커에 취하여 수욕상에서 용매를 완전히 증발하기 직전까지 유지시킨 다음 50℃이하의 감압에서 1시간 건조한다. 건조물은 차광 마개를 하여 보존한다. 사용 시 벤젠 1,000㎖에 디티존이 20㎎ 함유하도록 조제한다.

Ⓒ 구연산암모늄용액

구연산암모늄 45g을 물 100㎖에 녹이고 암모니아수를 가하여 pH 8～9로 한다. 이 액을 디티존클로로포름용액 20㎖씩으로 디티존용액이 고유의 녹색을 가질 때까지 추출한 다음 물층을 클로로포름 50㎖씩으로 2회 추출하여 물층을 분리하여 취한다.

Ⓓ 아황산나트륨용액

아황산나트륨(무수) 15g에 물을 가하여 100㎖로 한다(사용 시 조제). 이 용액을 디티존클로로포름용액으로 앞항 Ⓒ에 따라 처리한다.

Ⓔ 시안화칼륨용액

시안화칼륨 50g에 물을 가하여 100㎖로 한다. 이 액을 디티존클로로포름용액으로 앞항 Ⓒ에 따라 처리한다. 다만, 용액 중에 잔존하는 디티존을 제거하기 위해 클로로포름으로 10～20회 조작을 되풀이 하고 수용액에 물을 가하여 5배 용량으로 한다.

Ⓕ 묽은 시안화칼륨용액

시안화칼륨용액 10㎖에 물을 가하여 100㎖로 한다. 사용 시 조제한다.

Ⓖ 납표준용액

질산납 0.1598g을 질산(2.5→100)에 녹여 100㎖로 해서 보존액으로 한다. 사용시 질산(1→100)으로 100배 또는 1,000배로 희석하여 표준용액으로 한다.

납표준용액 1㎖＝10μl 또는 1㎕ Pb

㉯ 시험조작

시험용액 및 공시험용액 각 일정량을 취하여 구연산암모늄용액 2㎖ 및 메틸레드시액 2방울을 가하여 액이 황색이 될 때까지 암모니아수를 가하고 물을 가하여 전량을 약 100㎖로 한다.

이에 시안화칼륨용액 10㎖ 및 아황산나트륨용액 10㎖를 가하여 혼합하고 수욕상에서 10～15분간 가열한다. 식힌 다음 암모니아수 1.5㎖를 넣고 분액깔때기에 옮겨 디티존‧벤젠용액 10㎖를 정확히 가하여 1분간 강하게 흔들어서 분리한 물층을 제거한다. 다시 묽은 시안화칼륨용액 40㎖를 넣고 30초간 강하게 흔든 다음 물층을 버리고 벤젠층을 건조여과지로 여과한다. 벤젠층을 525㎚ 부근의 흡수극대 파장에서 흡광도 A 및 Ab를 측정한다.

동시에 납표준용액 10㎖(Pb 10㎕) 및 물 10㎖에 대해서 같은 조작을 하고 벤젠을 대조액으로 하여 흡광도 As 및 Ao를 측정한다.

[계산식]

[eqn: rm납(mg/kg)=10×{A-Ab}over{As-Ao}×{{시험용액전량}(itml)}over{검체의 양(g)}×{1}over{시험용액의 일정량(itml)}]

② 원자흡광광도법에 의한 정량

시험용액 및 공시험용액 각 일정량에 대하여 위의 2) 측정 (1) 원자흡광광도법에 따라 시험한다. 측정파장은 283.3㎚이다.

(3) 주석

① SATP법

㉮ 시약

Ⓐ SATP용액：아스코르빈산 1g을 소량의 물에 녹여 에탄올을 넣고 100㎖로 한다. 이 용액에 살리실리덴아미노 2-티오페놀(Salicyliden amino-2-thiophenol) 0.1g을 가열하여 녹인다(사용할 때마다 만든다).

Ⓑ 디니트로페놀용액：2, 4-디니트로페놀용액(2, 4-Dinitrophenol) 0.25g을 50v/v% 에탄올 100㎖에 녹인다.

Ⓒ 젖산용액： 젖산(특급) 20㎖에 물을 가하여 100㎖로 한다.

Ⓓ 수산화나트륨용액： 수산화나트륨 1g을 물에 녹여 100㎖로 한다.

Ⓔ 티오황산나트륨용액： 티오황산나트륨 1g을 물에 녹여 100㎖로 한다.

Ⓕ 주석표준용액： 금속 Sn 0.500g에 염산 30㎖를 가하여 수욕상에서 가열하여 녹인다. 식힌 다음 30% 과산화수소수 1㎖를 넣고 1N 염산으로 500㎖로 한다. 이 액 1㎖를 1N 염산에 넣어 100㎖로 한다.

주석표준용액 1㎖＝10㎍ Sn

㉯ 시험조작

시험용액 1.0～2.0㎖를 마개달린 시험관에 취하고 1N 염산을 넣어 10㎖로 한다. 이에 디니트로페놀용액 2방울을 가하여 10% 수산화나트륨용액으로 중화한 다음 물을 가하여 20㎖로 하고 20%(v/v) 젖산용액 2㎖를 넣는다. 다음에 1% 티오황산나트륨용액 1㎖, SATP용액 5㎖를 가하여 잘 섞고 20분간 정치한 다음 키실렌 10㎖를 가하여 격렬하게 흔들어 추출한다. 키실렌층을 취하여 공시험용액을 대조로 해서 파장 415㎚ 부근의 흡광도를 측정한다. 따로 주석표준용액 0.0, 1.0, 2.0, 3.0, 4.0 및 5.0㎖를 공전시험관에 취하고 1N 염산을 넣어 10㎖로 해서 시험용액과 같은 조작을 한 다음 각각의 흡광도를 측정하여 작성한 검량선으로부터 주석의 양을 구한다.

(4) 동

① 디에틸디티오카아바민산에 의한 정량법

㉮ 시약

Ⓐ 카아바메이트용액

디에틸디티오카아바민산나트륨(Sodium diethyl dithio -carbamate) 1g을 물에 녹여 100㎖로 하여 여과한다.

Ⓑ 구연산‧EDTA용액

구연산 제2암모늄 20g 및 에틸렌디아민 4초산 2나트륨(Ethylene diamine tetraacetic acid disodium salt) 5g을 물에 녹여 100㎖로 한다. 동의 흔적을 제거하기 위해 카아바메이트용액 0.1㎖를 가하고 사염화탄소 10㎖로 추출한다.

이 추출을 사염화탄소층이 무색이 될 때까지 되풀이 한다.

Ⓒ 티몰블루시액

티몰블루 0.1g을 물에 녹이고 청색이 될 때가지 0.1N 수산화나트륨액을 가한 다음 물을 가하여 100㎖로 희석한다.

Ⓓ 동표준용액

금속 동(표준품) 0.200g을 삼각플라스크에 취하여 질산(1→5) 15㎖를 넣고 플라스크를 시계접시로 덮고 약간 가온하여 녹인다. 발연이 없을 때까지 끓인 다음 200㎖로 한다. 이 용액 10.0㎖에 물을 가하여 100㎖로 하고 그 5.0㎖를 취하여 2N 황산을 가해서 200㎖로 한다.

동 표준용액 1㎖ ＝ 2μg Cu

㉯ 시험조작

시험용액 25㎖를 분액깔때기에 취하고 구연산‧EDTA용액 10㎖ 및 티몰블루시액 2방울을 넣은 다음 녹색 또는 청녹색이 될 때까지 6N 암모니아수를 적가한다. 식힌 다음 카아바메이트용액 1㎖ 및 사염화탄소 15㎖를 넣고 2분간 격렬하게 추출하여 사염화탄소층을 탈지면으로 여과하고 여액을 파장 400㎚에서 흡광도를 측정한다. 따로 작성한 검량선으로부터 동(Cu)의 함량을 구한다. 검량선은 표준용액 0.0, 1.0, 2.5, 10, 15, 20 및 25㎖를 각각 분액깔때기에 취하고 2N 황산으로 25㎖로 하여 이하 시험용액의 경우와 같은 조작을 해서 흡광도를 측정하여 만든다.

② 원자흡광광도법에 의한 정량

위의 2) 측정 (1) 원자흡광광도법에 따라 시험한다. 다만, 측정 파장은 324.7㎚이다.

(5) 수은

① 디티존법

㉮ 시약

Ⓐ 물：이온교환수지관을 통과한 정제수로 한다.

Ⓑ 황산‧질산용액(1+1)：질산에 같은 양의 황산을 가하여 혼합한다.

Ⓒ 클로로포름

클로로포름을 1/20용량의 진한 황산과 흔들어 섞어 황산층이 무색이 될 때까지 이 조작을 되풀이 한다. 다음에 1/5용량의 10% 수산화나트륨 용액으로 2회 씻고 다시 물로 씻은 다음 소량의 산화칼슘(CaO)을 가해서 증류한다. 이에 약 1/5용량의 0.5% 염산히이드록실아민용액을 넣고 흔들어 섞은 다음 클로로포름층을 취하여 1/100 용량의 에탄올을 가해서 냉암소에 보존한다.

Ⓓ 디티존‧클로로포름용액

디티존을 클로로포름에 녹여 디티존 100㎎/ℓ의 용액을 만들어 갈색병에 넣어 보존한다. 사용시 클로로포름으로 희석하여 Hg2+ 0～10μg의 정량에 대하여 디티존 5～6㎎/ℓ의 용액을 만든다.

Ⓔ 수은표준용액

염화제2수은 0.6767g을 달아 물 100～200㎖ 및 염산 5㎖를 가하여 녹이고 물로 500㎖로 한다. 사용 시 이를 물로 500배로 희석한다.

수은표준용액 1㎖＝2μgＨg2+

Ⓕ 1.5% 티오황산나트륨용액 : 사용시 만든다.

Ⓖ 과염소산나트륨용액 유효염소 5%

㉯ 시험조작

시험용액 및 공시험용액을 500㎖의 분액깔때기에 취하고 디티존‧클로로포름용액(5～6㎎/ℓ) 10㎖를 넣어 1분간 추출한다. 클로로포름층을 분취하여 0.1N 염산 50㎖와 20% 염산히드록실아민용액 5㎖를 넣은 제2의 100㎖ 분액깔때기에 옮긴다. 다시 제1의 분액깔때기에 디티존‧클로로포름용액 5㎖씩을 넣어 추출을 2회 되풀이 하고 클로로포름층을 제2의 분액깔때기에 넣는다. 제2의 분액깔때기를 1분간 추출하여 클로로포름층을 0.1N 염산 50㎖를 넣은 제3의 100㎖ 분액깔때기에 옮긴다. 제2의 분액깔때기 중의 용액을 클로로포름 1～2㎖로 씻고 씻은 액은 제3의 분액깔때기에 넣는다. 다음 제3의 분액깔때기에 티오황산나트륨용액 2㎖를 가해서 1분간 추출한 다음 클로로포름층을 버린다. 다시 클로로포름 1～2㎖로 물층을 씻고 클로로포름층을 제거한다.

물층에 과염소산나트륨용액 3㎖를 가해서 1분간 잘 흔들어 섞고 이에 20% 염산 히이드록실아민용액 5㎖를 분액깔때기의 입구 부분을 주의하여 씻으면서 흘려 내리고 1분간 잘 흔들어 섞는다. 분액깔때기 안에 가스 상태로 남아 있는 Cl2를 송풍기(Blower)로 바람을 보내어 제거하고 30% 초산 3㎖ 및 클로로포름 2～3㎖를 가해서 1분간 흔들어 섞은 다음 클로로포름층을 제거한다. 이에 디티존‧클로로포름용액(5～6㎎/ℓ) 10.0㎖를 가하여 1분간 흔들어 섞고 분액깔때기의 스톱코크(Stopcock) 및 그 밑 부분의 내부의 수분을 둥글게 한 작은 여지로 제거하고 탈지면을 분액깔때기의 밑부분에 끼워 넣어 디티존추출액을 모은 다음 파장 490㎚에서 클로로포름을 대조액으로 하여 흡광도를 측정한다. 따로 작성한 검량선으로부터 수은(Hg)의 함량을 구한다.

다만, 수은의 양이 10μg이상의 경우에는 제3의 분액깔때기의 내용액에서 검량선 범위에 들어가는 양을 취해 비색한다. 검량선 100㎖의 분액깔때기에 0.1N 염산 50㎖, 20% 염산히이드록실아민용액 5㎖ 및 30% 초산용액 3㎖와 수은표준용액 각각 0, 1, 2, 3, 4 및 5㎖를 넣고 이에 클로로포름 2～3㎖씩을 가하여 1분간 잘 흔들어 섞어 클로로포름층을 가능한 한 완전히 제거한다. 이에 디티존‧클로로포름용액(5～6㎎/ℓ) 10㎖를 가하여 1분간 추출하고 이를 시험용액의 경우와 동일하게 조작해서 흡광도를 측정한다.

② 원자흡광광도법에 의한 정량

㉮ 환원기화법

Ⓐ 시약

㉠ 염화제일주석용액： 염화제일주석 10g에 0.5N 황산을 가하여 녹여1,000㎖로 한다.

㉡ 수은표준용액

염화제이수은 0.135g을 10% 질산 100㎖에 녹이고 물을 가하여 1,000㎖로 한다. 사용 시 이 용액을 1% 질산으로 1,000배 희석하여 표준용액으로 한다.

수은표준용액 1㎖ ＝ 0.1㎕ Hg

Ⓑ 시험조작

시험용액 및 공시험용액을 20%(v/v) 황산농도로 조절하여 각 100㎖를 시험용액병에 취하여 환원기화장치에 연결한 다음 염화제일주석용액 10㎖를 가하여 즉시 마개를 막고 다이아프램펌프(diaphram pump)에 의해 공기를 흡수셀 중에 순환시켜 파장 253.7㎚에서 흡광도를 측정한다. 수은표준용액 0, 5, 10, 15, 20㎖에 물을 가해서 100㎖로 하여 시험용액과 같은 조작을 한 다음 각각의 흡광도를 측정하여 작성한 검량선으로부터 수은(Hg)의 함량을 구한다.

㉯ 금아말감법

Ⓐ 시약

㉠ 수은표준원액： 염화제이수은 135.4㎎을 0.001% L-시스테인 용액에 녹여 1,000㎖로 한다(어두운 곳에서 1～2개월간 보존).

1㎖ ＝ 100㎍ Hg

㉡ 수은표준용액： 수은표준원액을 0.001% L-시스테인용액으로 희석하여 0～20㎍/㎖로 한다(쓸 때에 만든다).

㉢ 첨가제：(a) 산화알루미늄 (b) 수산화칼슘 ＋ 탄산나트륨(1：1 혼합물)을 쓸 때에 950℃에서 30분간 활성화시킨다.

Ⓑ 장치

시료의 연소에서 금아말감에 의한 포집, 냉원자흡광법에 의한 측정까지를 자동화한 수은 측정장치를 쓴다.

Ⓒ 시험조작

첨가제(a) 약 1g을 도가니에 고르게 펴고 고체 검체는 그 위에 세절 또는 균질화한 시료를 10～300㎎, 액체검체는 0.1～0.5㎖를 첨가제 (a)에 완전히 스며들게 하고, 그 위에 첨가제 (a) 약 0.5g, (b) 약 1g을 차례로 고르게 펴 층을 이루게 한다.

도가니를 연소부에 넣고 공기 또는 산소를 0.521ℓ/min를 통과하면서 약 900℃로 가열하여 수은을 유지시켜 포집관에 수은을 포집한다.

포집관을 약 700℃로 가열하여 수은증기를 냉원자흡광분석장치에 보내고, 흡광도를 측정하여 A로 한다. 따로 도가니에 첨가제만을 취해 같은 조작을 되풀이하여 흡광도를 측정하여 Ab로 한다.

다음 수은표준용액을 써서 같은 조작을 되풀이하여 얻어진 흡광도에서 검량선을 작성하여 A-Ab 값을 검량선으로부터 검체 중의 수은량을 산출한다.

4) 중금속

(1) 시약

① 납표준용액： 위의 3) 금속별시험 (2) 납 중의 납표준용액과 같다.

(2) 시험

시험용액 5～20㎖를 비색관에 취하고 따로 비색관에 납표준용액 1, 2, 3, …10㎖를 가한 다음 각각 암모니아수로 중화하고 염화암모늄 1g, 10% 초산용액 3㎖ 및 황화나트륨시액 1～2방울을 각각 가한 다음 물을 가하여 50㎖로 하여 비색하여 중금속의 함량을 구한다.

6. 이물시험법

1) 체분별법

검체가 미세한 분말일 때 비교적 큰 이물을 체로 포집하여 육안으로 검사한다. 필요에 따라 이물의 종류를 확인하고자 할 때는 현미경으로 약 40배 정도의 저배율로 본다. 이하 이물시험에 있어서는 모두 이와 같다.

2) 여과법

검체가 액체일 때 또는 용액으로 할 수 있을 때 그 용액을 신속여과지로 여과하여 여과지상의 이물을 검사한다.

3) 와일드만 라스크법

곤충 및 동물의 털과 같이 물에 잘 젖지 아니하는 가벼운 이물은 물과 혼합되지 않은 용매와 저어 섞음으로써 유기용매 층에 떠오르게 하여 취할 수 있다.

그림 6-4.

油層

境界

水層

와일드만플라스크 중에 검체를 물 및 기타 지정액(1ℓ 의 플라스크에서는 600㎖, 2ℓ에서는 900㎖ )과 섞어 다시 휘발유(무색투명하고 납을 함유하지 아니하는 것), 피마자유 등 물과 섞이지 않는 포집액을 넣어 플라스크를 약 45°기울여 교반봉으로 1분에 약 200～250회 저어 섞는다(이 때 공기의 기포가 들어가지 않도록 주의한다). 그 후 20분간은 수분마다 저어 섞고 약 30분간 방치한 다음 두 액층의 경계가 그림에서와 같은 위치에 올 때까지 물 또는 지정액을 조용히 부어 넣고 고무마개로 플라스크의 기벽을 긁어 부착해 있는 기름방울을 부상시켜 더욱 손잡이를 급속도로 회전시켜 고무마개에 부착된 검체와 기름을 털어내고 마개를 끌어 올려 플라스크의 목에 밀착시키고 이물을 포함한 기름층을 소량의 하층액과 함께 비커에 기울여 취하고 알코올 및 물로 막대기, 고무마개 및 플라스크 내벽을 씻어 그 씻은 액을 비커에 합쳐 그 액을 흡인 여과하여 여과지상에 이물이 있는가를 검사한다.

현미경으로 검사하고자 할 때는 글리세린‧알코올혼액(1：1) 약 5㎖를 담은 페트리접시에 여과지를 옮겨 잘 적신 후 검사한다. 다시 와일드만플라스크에 포집액 10～20㎖를 넣어 잘 저어 섞고 때때로 하층액을 저으면서 약 10～20분간 방치한 다음 먼저와 같이 조작하여 이물을 검사한다. 기울여 따라 포집한 액이 다량의 식품조직을 함유할 때 또는 여과지에 식물조직이 다량 혼입되어 현미경 검사가 어려울 때는 다시 새로운 와일드만플라스크에 옮겨 물로 잘 혼합시켜 먼저와 같이 포집하고 식물조직을 하층액에 옮겨 포집액을 여별한다. 다만, 이 조작은 이물의 손실을 초래할 염려가 있으므로 처음의 포집조작에서 가급적 검체가 떠오르지 않게 하는 것이 중요하다.

하층액으로서 포화식염수 또는 수성알코올을 사용하면 식물 조직의 떠오름을 어느 정도 방지할 수 있다.

4) 침강법

쥐똥, 토사등의 비교적 무거운 이물의 검사는 검체에 클로로포름(또는 4염화탄소, 에테르 또는 메탄올 등을 가하여 그 비중을 1.49로 한 것)을 가하여 저어 섞으면 이물은 용기의 밑에 가라앉는다.

바닥의 이물이 떠오르지 않게 조심하여 상층액을 기울여 버리고 바닥에는 클로로포름 소량과 이물만 남게 하고 이를 흡인 여과하여 여과지상에 이물이 있는가를 검사한다. 현미경검사를 하고자 할 때는 글리세린‧알코올혼합액(1：1)을 넣은 페트리접시에 여과지를 옮겨 잘 적신 후 검사한다.

7. 미생물시험법

미생물시험에 있어서 제일 유의하여야 할 점은 검체중의 미생물의 상황이 시시각각으로 변하여 증식하거나 사멸하는 수가 있으며 원래 검체 중에 함유되어 있던 미생물 외에 별개의 미생물이 시험조작중 오염될 수 있다는 것이다.

이와 같은 시험상의 오염을 방지하기 위하여 시험조작은 원칙적으로 무균조작이어야 하며 동시에 실험실내는 청결을 유지하여야 한다.

1) 일반사항

(1) 검체의 채취 및 취급

① 채취방법

㉮ 검체가 균질한 상태일 때에는 어느 일부분을 채취하여도 무방하나 불균질한 상태일 때에는 일반적으로 많은 양의 검체를 채취하여야 한다.

㉯ 미생물학적 검사를 하는 검체는 잘 섞어도 균질하게 되지 않을 수 있기 때문에 실제와는 다른 검사 결과를 가져올 경우가 많다.

예를 들면 우유 한 병(180㎖)에서 검체 1㎖를 취하여 대장균군 시험을 할 때 이 한 병 중에 90개의 대장균군이 있어도 검출되지 않을 확률이 60.7%나 된다. 그러므로 가능한 한 검체를 잘 섞어 균질에 가깝도록 하여 검체를 채취하여야 한다.

㉰ 미생물학적 검사를 위한 검체의 채취는 반드시 무균적으로 행하여야 하며 멸균한 용기(유리제용기, 페트리접시 등)에 넣어 원칙적으로 저온(5±3℃)으로 유지시키면서 빨리(검체 채취 후 4시간이내) 검사기관에 운반하여야 하며 될 수 있는 대로 빨리 시험에 착수하여야 한다. 부득이 저온으로 검체를 유지할 수 없거나 즉시 운반이 곤란할 경우에는 반드시 채취 일시 및 채취 당시의 검체 상태를 상세히 기록하여야 한다. 특히 신선한 어패류와 같이 세균의 증식이 적당한 검체는 채취와 운반에 특히 주의하여야 한다.

㉱ 검체 채취기구는 미리 핀셋, 스푼, 스파테르 등을 몇 개씩 건열 및 화염멸균을 한 다음 검체 1건마다 바꾸어 가면서 사용하여야 한다.

㉲ 미생물학적 검사용 검체일지라도 곡분이나 분유와 같이 건조되어 잘 변질 또는 부패되지 않는 검체는 냉장상태에서 운반할 필요는 없으나 2차 오염을 방지하기 위하여 밀봉 또는 밀폐하여야 한다.

㉳ 냉장운반을 위하여 얼음을 사용할 때에는 2차 오염을 방지하기 위하여 얼음이나 그 녹은 물이 검체에 직접 접촉되지 않도록 하여야 한다.

㉴ 시험에 사용되는 검체의 균질화를 위하여 액상검체인 경우에는 강하게 진탕하여 균질화하고 고형 및 반고형인 검체는 균질기(homogenizer 또는 stomacher)를 이용하여 적당량의 희석액과 혼합하여 균질화한 것을 검액으로 사용한다.

㉵ 칼‧도마 및 식기류에서 검체를 채취할 때에는 멸균한 탈지면에 멸균생리식염수를 적셔, 검사하고자 하는 기구의 표면을 완전히 닦아낸 탈지면을 무균용기에 넣어 시험용액으로 사용한다.

② 시험용액의 조제

일반적인 주의사항으로서는 검체를 무균적으로 취급하는 것이다. 미생물의 수가 적은 것으로 예상되는 검체에 대해서는 특히 신중히 취급하여야 한다.

㉮ 액상검체： 채취된 검체를 강하게 진탕하여 혼합한 것을 시험용액으로 한다.

㉯ 반유동상검체： 채취된 검체를 멸균유리봉과 멸균스파테르 등으로 잘 혼합한 후 그 일정량(10～25㎖)을 멸균용기에 취해 9배 양의 멸균생리식염수와 혼합한 것을 시험용액으로 한다.

㉰ 고체검체： 채취된 검체의 일정량(10～25g)을 멸균된 가위와 칼 등으로 잘게 자른 후 멸균생리식염수를 가해 균질기를 이용해서 가능한 한 저온으로 균질화한다. 여기에 멸균생리식염수를 가해서 일정량(100～250㎖)으로 한 것을 시험용액으로 한다.

㉱ 고체표면검체： 검체표면의 일정면적(보통 100㎝2)을 일정량(1～5㎖)의 멸균생리식염수로 습한 멸균가제와 면봉 등으로 닦아내어 일정량(10～100㎖)의 멸균생리식염수를 넣고 세게 진탕하여 부착균의 현탁액을 조제하여 시험용액으로 한다.

㉲ 분말상검체： 검체를 멸균유리봉과 멸균스파테르 등으로 잘 혼합한 후 그 일정량(10g)을 멸균용기에 취해 9배 양의 멸균생리식염수와 혼합한 것을 시험용액으로 한다.

㉳ 캅셀제품류： 캅셀을 포함하여 검체의 일정량(10～25g)을 취한 후 9배 양의 멸균생리식염수를 가해 균질기와 스토마커 등을 이용하여 균질화한 것을 시험용액으로 한다.

이와같이 조제된 시험원액에 대해서는 멸균생리식염수를 이용하여 필요에 따라 10배, 100배, 1,000배… 희석액을 만들어 사용한다.

시험용액의 조제 시 검체를 용기 포장한 대로 채취할 때에는 그 외부를 물로 씻고 자연건조시킨 다음 마개 및 그 하부 5～10㎝의 부근까지 70% 알코올탈지면으로 닦고, 화염멸균한 후 냉각하고 멸균한 기구로 개봉, 또는 개관하여 2차 오염을 방지하여야 한다. 지방분이 많은 시료의 경우는 Tween 80과 같은 세균에 독성이 없는 계면활성제를 첨가하는 것이 좋다.

㉴ 냉동건강기능식품은 냉동상태의 검체를 포장된 상태 그대로 40℃이하에서 될 수 있는 대로 단시간에 녹여 용기, 포장의 표면을 70% 알코올 솜으로 잘 닦은 후 상기 ㉮～㉳의 방법으로 시험용액을 조제한다.

(2) 배지

① 표준한천배지(균수측정용)：Standard Methods Agar(Plate Count Agar)

Tryptone	5.0g
Yeast Extract	2.5g
Dextrose	1.0g
Agar	15.0g

위의 성분에 증류수를 가하여 1,000㎖로 만들고 멸균한 후 pH 7.0±0.2로 조정한 후 121℃로 15분간 멸균한다.

② 유당배지(Lactose Broth)

Peptone	5.0g
Beef Extract	3.0g
Lactose	5.0g

위의 성분을 증류수 1,000㎖에 녹여 pH 6.9±0.2로 조정한 후 121℃에서 15분간 멸균한다.

③ BGLB배지(Brilliant Green Lactose Bile Broth)

㉮ 펩톤 10g 및 유당 10g을 증류수 500㎖에 녹인다.

㉯ 신선한 우담즙 200㎖(또는 건조 우담즙말 20g)을 증류수 200㎖에 녹인 것으로서 pH 7.2±0.2가 되도록 한 것을 가한다.

㉰ 이에 물을 가하여 전량이 약 975㎖가 되도록 하고 pH 7.4로 조정한다.

㉱ 0.1% Brilliant Green 수용액 13.3㎖를 가한다.

㉲ 전량 1,000㎖를 탈지면으로 여과하여 분주할 때 발효관에 넣고 상법에 따라 멸균한다(멸균후의 pH 7.2±0.1).

④ 두배농도 BGLB배지

펲톤 10g 및 유당 10g을 증류수 250㎖에 녹이고 이에 신선한 우담즙 200㎖ 또는 건조 우담즙말 20g을 증류수 200㎖에 녹인 것으로서 pH 7.2±0.2의 것을 가하여 약 480㎖로 하여 pH 7.4로 조정하고 여기에 0.2% brilliant green 수용액 13.3㎖를 가하여 전량을 500㎖로 하고 탈지면으로 여과하여 발효관에 약 10㎖씩 분주한 후 멸균한다(멸균후의 pH 7.1～7.4로 한다).

⑤ Endo 한천배지(Endo Agar)

Dipotassium Phosphate(K2HPO4)	3.5g
Peptone	10.0g
Lactose	10.0g
Sodium Sulfite	2.5g
Basic Fuchsin	0.5g
Agar	15.0g

위의 성분을 증류수 1,000㎖에 녹여 pH 7.4±0.2로 조정한 후 121℃에서 15분간 멸균한다.

⑥ EMB 한천배지(Eosine Methylene Blue Agar)

Peptone	10.0g
Lactose	5.0g
Sucrose	5.0g
Dipotassium Phosphate	2.0g
Eosin Y	0.4g
Methylene Blue	0.065g
Agar	13.5g

위의 성분을 증류수 1,000㎖에 녹여 pH 6.8±0.2로 조정한 후 121℃에서 15분간 멸균한다.

⑦ 보통배지(Nutrient Broth)

Peptone	5.0g
Beef Extract	3.0g

위의 성분을 증류수 1,000㎖에 녹여 pH 7.0～7.4로 조정한 후 121℃에서 15분간 멸균한다.

⑧ 보통한천배지(Nutrient Agar)

보통배지 1,000㎖에 정제한천 15g을 가하여 가열 용해하고 증류수량을 보정한다. pH 6.8±0.2로 조정한 후 121℃에서 15분간 멸균한다.

⑨ 데스옥시콜레이트유당한천배지(Desoxycholate Lactose Agar)

Peptone	10.0g
Lactose	10.0g
Sodium Chloride	5.0g
Sodium Citrate	2.0g
Sodium Desoxycholate	0.5g
Agar	15.0g
Neutral Red	0.03g

위의 성분을 증류수 1,000㎖에 녹여 pH 7.3～7.5로 조정한 후 1분간 끓여서 용해시켜 멸균하지 않고 즉시 사용할 수 있다(고압증기멸균하면 배지의 pH가 떨어져 데스옥시콜산나트륨이 침전할 수 있으므로 피하는 것이 좋다).

EC 배지(EC Broth)

Peptone	20.0g
Lactose	5.0g
Bile Salt Mixture	1.5g
Dipotassium Phosphate	4.0g
Monopotassium Phosphate	1.5g
Sodium Chloride	5.0g

위의 성분을 증류수 1,000㎖에 녹여 pH 6.9±0.2로 조정하여 시험관에 분주하여 발효관을 넣은 후 121℃에서 15분간 멸균한다.

BCP첨가 평판측정용 한천배지(Plate Count Agar with Brom Cresol Purple)

Yeast Extract	2.5g
Peptone	5.0g
Dextrose	1.0g
Tween 80	1.0g
L-Cysteine	0.1g
Agar	15.0g

위의 성분(다만, 종균에 따라 적정 peptone을 사용하여야 함)을 증류수 1,000㎖에 녹여 pH 6.8～7.0으로 조정한 후 BCP(Brom cresol purple)을 0.004～0.006%가 되도록 가하고 121℃에 서  15분간 멸균한다.

포테이토덱스트로즈 한천배지(Potato Dextrose Agar)

Potato, Infusion from	200.0g
Dextrose	20.0g
Agar	15.0g

위의 성분을 증류수 1,000㎖에 녹여 pH 5.6±0.2로 조정하고 121℃에서 15분간 멸균하여 식힌 후 멸균된 10% 주석산을 무균적으로 가하여 pH를 3.5±0.1로 맞춘다.

티오글리콜린산염배지(Fluid Thioglycollate Medium)

Yeast Extract	5.0g
Casitone	15.0g
Dextrose	5.0g
Sodium Chloride	2.5g
L-Cystine	0.75g
Thioglycollic Acid	0.5g
Agar	0.75g
Resazurin	0.001g

위의 성분을 증류수 1,000㎖에 녹여 pH를 7.1±0.2로 조정하고 121℃에서 15분간 멸균한 후 찬물에 급냉하여 레자즈린층이 나타나게 한다.

난황첨가 만니톨 식염한천배지(Mannitol Salt Agar with Egg Yolk Agar)

Beef Extract	2.5g
Peptone	10g
Mannitol	10g
Sodium Chloride	75g
Phenol Red	25mg
Agar	15g

위의 성분을 증류수 1,000㎖에 녹여 가열 용해한 후 pH 7.2～7.6으로 조정한 후 121℃에 서  15분간 멸균한다.

멸균시킨 배지를 50℃정도로 식혀 난황액(난황에 동량의 멸균생리식염수를 가한 것)을 10%의 비율로 무균적으로 가해 잘 혼합한 후 사용한다.

BL 한천배지(BL Agar)

Beef Extract Liver Extract Yeast Extract Proteose Peptone Tryptone Soypeptone Soluble Starch Glucose Dipotassium Phosphate Monopotassium Phosphate Magnesium Sulfate Sodium Chloride Manganese Sulfate L-Cysteine‧HCl‧H2O Ferrous Sulfate Polysorbate 80(Tween 80) Agar	3g 5g 5g 10g 5g 3g 0.5g 10g 1g 1g 0.2g 0.01g 0.00674g 0.5g 0.01g 1g 15g

위의 성분을 증류수 1,000㎖에 녹여 pH 7.2로 조정한 후 121℃에서 15분간 멸균하여, 50℃로 냉각시킨 후 소, 말, 양 또는 사람의 탈섬유소 혈액을 5% 되도록 첨가한다.

펩톤수(Alkaline Peptone Water：2% NaCl을 가한 것)

Peptone	10g
Sodium Chloride	20g

위의 성분을 증류수 1,000㎖에 녹여 pH 8.6(당을 포함한 제품의 경우에는 pH 9.2)으로 조정한 후 10㎖씩 분주하여 121℃에서 15분간 멸균한다.

TCBS 한천배지(Thiosulfate Citrate Bile Salt Sucrose Agar)

Yeast Extract	5g
Peptone	10g
Sodium Citrate	10g
Sodium Thiosulfate	10g
OXgall	5g
Sodium Cholate	3g
Sucrose	20g
Sodium Chloride	10g
Ferrous Citrate	1g
Brom Thymol Blue	0.04g
Thymol Blue	0.04g
Agar	15g

위의 성분을 증류수 1,000㎖에 녹여 가열한 후 50℃정도로 식혀 멸균페트리접시에 붓는다. 최적 pH는 8.6이며 고압증기멸균을 해서는 아니된다.

LIM 반유동배지

Peptone	10g

Yeast Extract	3g

Dextrose	3g

Brom Cresol Purple	0.02g

L-Lysin Hydrochloride	10g

L-Tryptophan	0.5g

Agar	3g

위의 성분을 증류수 1,000㎖에 녹여 pH 6.7로 조정한 후 시험관에 분주하여 121℃에서 15분간 멸균하여 사용한다.

VP반유동배지

Yeast Extract	1g

Casein peptone	7g

Soypeptone	5g

Dextrose	10g

NaCl	5g

Agar	3g

위의 성분을 증류수 1,000㎖에 녹인 후 pH 7.0～7.2로 조정한 후 시험관에 분주하여  121℃에서 15분간 멸균한다.

Purple Broth Base

Proteose Peptone	10g

Beef Extract	1g

Sodium Chloride	5g

Brom Cresol Purple	0.015g

위의 성분을 증류수 1,000㎖에 녹여 pH 6.8±0.2로 조정한 후  121℃에서 15분간 멸균한다.

Moeller Basal Broth

Peptone	5g

Beef Extract	5g

Dextrose	0.5g

Brom Cresol Purple	0.01g

Cresol Red	0.005g

Pyridoxal Hydrochloride	0.005g

위의 성분을 증류수 1,000㎖에 녹여 pH 6.0으로 조정한 후 시험관에 분주하여 121℃ 에서 15분간 멸균한다. 균을 접종 후 멸균 유동파라핀을 중층한다.

ONPG (O-nitrophenyl-β-D-galacto-pyranoside) broth

0.5% NaCl을 가한 Peptone수 75㎖에 ONPG 용액 25㎖를 첨가한다. 시험관에 ONPG Broth 2.5㎖씩 분주한다.

* ONPG용액：ONPG 6g을 0.01M 인산수소이나트륨 1,000㎖에 용해하여 pH를 7.5로 조정한다.

TSB 배지(Tryptic Soy Broth)

Tryptone	17g

Soytone	3g

Dextrose	2.5g

Sodium Chloride	5g

Dipotassium Phosphate	2.5g

위의 성분을 증류수 1,000㎖에 녹여 pH 7.3±0.2로 조정한 후 121℃에서 15분간 멸균한다.

3% Ogawa 배지(3% KH2PO4)

Monopotassium Phosphate	3g

Sodium Glutamate	1g

위의 성분을 증류수 100㎖에 녹여 100℃에서 30분간 끓인다. 이 기초액에 전란액(全卵液) 200㎖, Glycerin 6㎖, 2% Malachite Green 수용액 6㎖씩 취하여 충분히 혼합한 후 5～6㎖씩 멸균시험관 또는 U.C 병에 분주한 다음 85～90℃에서 60분간 가열한다.

BS 한천배지(Bifidobacterium selective Agar)

Sodium Propionate	15g

Paromomycin Sulfate	50mg

Neomycin	100mg

Lithium Chloride	3g

BL한천배지(배지 15) 1,000㎖에 위의 성분을 첨가하여 조제한 후 121℃에서 15분간 멸균한다.

Liver Agar

Beef Liver, infusion from	500g

Proteose Peptone	10g

Sodium Chloride	5g

Agar	20g

위의 성분을 증류수 1,000㎖에 녹인 후 121℃에서 15분간 멸균한다.

클로스트리디움퍼프린젠스 한천배지(Clostridium perfringens Agar)

Heart Infusion	5g

Casein Peptone	10g

Proteose Peptone	10g

Sodium Chloride	5g

Lactose	10g

Phenol Red	50mg

Agar	20g

위의 성분을 증류수 1,000㎖에 녹여 pH 7.5～7.7로 조정한 후 121℃에서 15분간 멸균 후 배지를 50℃정도로 식혀 난황액(난황에 동량의 멸균생리식염수를 가한 것)을 10% 가 되도록 첨가한다.

Selenite F Broth

Polypeptone	5.0g

Lactose	4.0g

Disodium Phosphate	10.0g

Sodium Selenite	4.0g

위의 성분을 증류수 1,000㎖에 녹여 pH 7.0±0.2로 조정한 후 100℃에서 30분간 끓인다.

SS 한천배지(Salmonella Shigella Agar)

Beef Extract	5.0g

Proteose Peptone	5.0g

Lactose	10.0g

Bile Salt No.3	8.5g

Sodium Citrate	8.5g

Sodium Thiosulfate	8.5g

Ferric Citrate	1.0g

Agar	13.5g

Brilliant Green	0.0033g

Neutral Red	0.025g

위의 성분을 증류수 1,000㎖에 녹여 pH 7.0±0.2로 조정한 후 100℃로 끓여 완전용해한다.

MacConkey Agar

Peptone	17.0g

Polypeptone	3.0g

Lactose	10.0g

Bile Salts No.3	1.5g

Sodium Chloride	5.0g

Neutral Red	0.03g

Crystal Violet	0.001g

Agar	13.5g

위의 성분을 증류수 1,000㎖에 녹여 pH 7.1±0.2로 조정하고 가열 용해한 후  121℃에서 15분간 멸균한다.

Desoxycholate Citrate Agar

Beef Extract	5.0g

Peptone	5.0g

Lactose	10.0g

Sodium Citrate	8.5g

Sodium Thiosulfate	5.4g

Ferric Ammonium Citrate	1.0g

Sodium Desoxycholate	5.0g

Neutral Red	0.02g

Agar	12.0g

위의 성분을 증류수 1,000㎖에 녹여 pH 7.5±0.2로 조정한 후 끓인다.

TSI 한천배지(Triple Sugar Iron Agar)

Beef Extract	3.0g

Yeast Extract	3.0g

Peptone	20.0g

Lactose	10.0g

Sucrose	10.0g

Dextrose	1.0g

Ferrous Sulfate	0.2g

Sodium Chloride	5.0g

Sodium Thiosulfate	0.3g

Phenol Red	0.24g

Agar	13.0g

위의 성분을 증류수 1,000㎖에 녹여 pH 7.4±0.2로 조정한 후 121℃에서 15분간 멸균한다.

Cooked Meat Medium

Beef Heart	500g

Peptone	10g

Glucose	2g

Sodium Chloride	5g

위의 성분을 증류수 1,000㎖에 녹여 pH 7.2±0.2로 조정한 후 121℃에서 15분간 멸균한다.

GAM 당분해용 반유동 배지

Peptone	10g

Soytone	3g

Proteose Peptone	10g

Bovin Serum Albumin	13.5g

Yeast Extract	5g

Beef	2.2g

Potassium Phosphate, Monobasic	2.5g

Liver	1.2g

Sodium Chloride	3g

L-Cystein	0.3g

Sodium Thioglychollate	0.3g

Agar	1.5g

Sugar	10g

위의 성분을 증류수 1,000㎖에 가온용해 후 당을 가해서 작은 시험관에 분주하여 110～115℃에서 15분간 멸균 후 급냉시킨다.

Listeria Enrichment Broth

Tryptone	17g

Soytone	3g

Glucose	2.5g

Sodium Chloride	5g

Potassium Phosphate, Dibasic	2.5g

Yeast Extract	6g

Cycloheximide	0.05g

Acriflavin HCl	0.015g

Nalidixic Acid	0.04g

위의 성분을 증류수 1,000㎖에 녹여 pH 7.3±0.2로 조정한 후 121℃에서 15분간 멸균한다.

UVM Modified Listeria Enrichment Broth

Tryptose	10g

Beef Extract	5g

Yeast Extract	5g

Sodium Chloride	20g

Sodium Phosphate, Dibasic	9.6g

Potassium Phosphate, Monobasic	1.35g

Esculin	1g

Nalidixic Acid	0.02g

Acriflavin HCl	0.012g

위의 성분을 증류수 1,000㎖에 녹여 pH 7.2±0.2로 조정한 후 121℃에서 15분간 멸균한다.

Fraser Listeria Broth

Tryptose	10g

Beef Extract	5g

Yeast Extract	5g

Sodium Chloride	20g

Sodium Phosphate, Dibasic	9.6g

Potassium Phosphate, Monobasic	1.35g

Esculin	1g

위의 성분을 증류수 1,000㎖에 녹여 121℃에서 15분간 멸균하여 50℃로 식힌 후 Nalidixic Acid 0.02g, Acriflavin HCl 0.021g, Lithium Chloride 3g을 여과 멸균하여 가한다.

Oxford Agar

Columbia Blood Agar Base	39g

Esculin	1g

Ferric Ammonium Citrate	0.5g

Lithium Chloride	15g

Agar	2g

위의 성분을 증류수 1,000㎖에 녹여 pH 7.0±0.2로 조정한 후 121℃에서 15분간 멸균한다. 이를 50℃정도로 식힌 후 Cycloheximide 400㎎, Colistin Sulfate 20㎎, Acriflavin 5㎎, Cefotetan 2㎎, Fosfomycin 10㎎을 여과멸균하여 가한다.

LPM 한천배지(Lithium Chloride Phenylethanol Moxalactam Agar)

Thyptose	10g

Beef Extract	3g

Sodium Chloride	5g

Lithium Chloride	5g

Glycine Anhydride	10g

Phenylethanol	2.5g

Agar	15g

위의 성분을 증류수 1,000㎖에 녹여 pH 7.3±0.2로 조정한 후 121℃에서 15분간 멸균한다. 이를 50℃정도로 식힌 후 Moxalactam 20㎎을 여과 멸균하여 가한다.

Tryptic Soy Agar

Tryptose	17g

Soytone	3g

Glucose	2.5g

Sodium Chloride	5g

Dipotassium Phosphate	2.5g

Agar	15g

위의 성분을 증류수 1,000㎖에 녹여 pH 7.3±0.2로 조정 후 121℃에서 15분간 멸균한다.

TSC 한천배지(Tryptose-Sulfite-Cycloserine Agar)

Tryptose	15g

Yeast Extract	5g

Soytone	5g

Ferric Ammonium Citrate	1g

Sodium Metabisulfite	1g

Agar	20g

위의 성분에 증류수 900㎖를 가하여 녹인 후 pH를 7.6±0.2로 조정한다. 이를 500㎖ Flask에 250㎖씩 분주한 후 121℃에서 15분간 멸균한다. 이 배지를 50℃에 보관한다.

D-cycloserine solution∶D-cycloserine 1g을 200㎖의 증류수로 용해한 후 여과멸균하고 사용할 때까지 4℃로 보관한다.

Final medium∶250㎖ base에 D-cycloserine 용액 20㎖를 넣은 후 “ 클로스트리디움 퍼프린젠스한천배지”와 같은 방법으로 난황액을 넣고 분주한다.

mEC 배지

Tryptone	20g

Bile Salt No.3	1.12g

Lactose	5.0g

Dipotassium Phosphate	4.0g

Monopotassium Phosphate	1.5g

Sodium Chloride	5g

위의 성분을 증류수 1,000㎖에 녹여 pH 6.9±0.2로 조정한 후 121℃에서 15분간 멸균하여 식히고, 여과멸균한 novobiocin sodium salt 용액(0.02g/ℓ)을 첨가한다.

MacConkey Sorbitol 한천배지

Peptone	15.5g

Proteose Peptone	3g

d-Sorbitol	10g

Bile Salts	1.5g

Sodium Chloride	5g

Agar	15g

Neutral Red	0.03g

Crystal Violet	0.001g

위의 성분을 증류수 1,000㎖에 녹인 후 pH 7.1로 조정한 후 121℃에서 15분간 멸균한다.

PSBB 배지(Peptone Sorbitol Bile Broth)

Disodium Phosphate	8.23g

Monosodium Phosphate	1.2g

Bile Salts No.3	1.5g

Sodium Chloride	5g

d-Sorbitol	10g

Peptone	5g

위의 성분을 증류수 1,000㎖에 녹인 후 pH 7.6으로 조정하고 121℃에서 15분간 멸균하여 사용한다.

CIN 한천배지(Cefsulodin Irgasan Novobiocin Agar)

Peptone	20g

Yeast Extract	2g

Mannitol	20g

Sodium Pyruvate	2g

Sodium Chloride	1g

Magnesium Sulfate 7H2O(10mg/㎖)	1㎖

Agar	12g

위의 성분을 750㎖의 증류수에 녹여 충분히 끓인 후 80℃로 식히고 95% ethanol에 녹인 0.4% Irgasan을 1㎖ 넣어 완전히 섞는다. 다음으로 200㎖의 데스옥시콜레이트 용액(증류수 200㎖에 sodium desoxycholate 0.5g을 녹인 것)에 neutral red 10㎖(3㎎/㎖), crystal violet 10㎖(0.1㎎/㎖), cefsulodin 10㎖(1.5㎎/㎖), novobiocin 10㎖(0.25㎎/㎖)를 가하여 준다. 천천히 흔들면서 10% strontium chloride 10㎖를 넣는다. 1N NaOH로 pH 7.4로 맞춘 후 분주하여 사용한다. 이 때 멸균 후 첨가하는 모든 시약은 제균하여 사용한다.

MYP 한천배지(Mannitol Egg Yolk Polymyxin agar)

Beef Extract	1g

Peptone	10g

Mannitol	10g

Sodium Chloride	10g

Phenol Red	0.025g

Agar	15g

위의 성분을 900㎖의 증류수에 녹이고 pH 7.2로 조정한 후 500㎖ flask에 225㎖씩 분주‧멸균하여 50℃로 식힌다. 225㎖의 배지에 polymyxin B 용액(10,000unit/㎖) 2.5㎖와 50% 난황액 12.5㎖를 넣어 혼합 후 분주한다.

◦ 50% 난황액 조제 방법

계란을 1시간 가량 0.1% HgCl2에 담근 후 꺼내 70% ethanol에 30분 가량 담궈 놓는다. 계란을 꺼내 노른자만 취한 후 동량의 0.85% 식염수를 가하여 사용한다.

HUNT 배지

Beef Extract Powder	10g

Peptone	10g

Sodium Chloride	5g

Yeast Extract	6g

위의 성분을 증류수 950㎖에 녹인 후 pH 7.5로 조정하고 121℃에서 15분간 멸균하여 식히고 용혈시킨 말 혈액 50㎖, 항생제 혼합액 1 또는 항생제 혼합액 2를 16㎖ 가하고, FBP용액 4㎖를 혼합한다.

◦ 항생제 혼합액 1

Sodium Cefoperazone(0.8g/100㎖), Trimethoprim Lactate(0.375g/100㎖), Vancomycin(0.25g/100㎖), Amphotericin B(0.05g/100㎖)용액 각 4㎖씩을 혼합한다.

◦ 항생제 혼합액 2

Sodium Cefoperazone(0.8g/100㎖), Trimethoprim Lactate(0.375g/100㎖), Vancomycin(0.25g/100㎖), Rifampicin(0.125g/100㎖)용액 각 4㎖씩을 혼합한다.

◦ FBP용액：ferrous sulfate, sodium metabisulfite, sodium pyruvate 6.25g씩을 증류수 100㎖에 녹인다.

Modified Campy blood free 한천배지

CCDA agar base(Oxoid)	45.5g

Yeast Extract	2g

위의 성분을 증류수 1,000㎖에 녹여 pH 7.4로 맞춘 후 121℃에서 15분간 멸균하여 식히고, sodium cefoperazone 용액(0.8g/100㎖) 4㎖, rifampicin용액(0.125g/100㎖) 4㎖, amphotericin B 용액(0.05g/100㎖) 4㎖를 첨가한다.

Abeyta-Hunt blood 한천배지

Heart infusion broth	25g

Agar	15g

Yeast Extract	2g

위의 성분을 증류수 950㎖에 녹여 pH 7.4로 맞춘 후 121℃에서 15분간 멸균하여 식히고, sodium cefoperazone 용액(0.8g/100㎖) 4㎖, rifampicin 용액(0.125g/100㎖) 4㎖, amphotericin B 용액(0.05g/100㎖) 4㎖, 용혈시킨 말 혈액 50㎖를 첨가한다.

TPGY배지

Trypticase	50g

Peptone	5g

Yeast Extract	20g

Dextrose	4g

Sodium Thioglycollate	1g

위의 성분을 증류수 1,000㎖에 녹인 후 pH 7.0으로 조정하고, 15㎖씩 시험관에 분주하여 121℃에서 10분간 멸균한 후 냉장 보관한다.

Liver-Veal 난황한천배지

Liver-Veal Agar(Difco)	48.5g

Liver-Veal Agar를 증류수 500㎖에 녹여 121℃에서 15분간 멸균한 후, 50℃정도로 식혀 난황액(난황에 동량의 멸균생리식염수를 가한 것) 40㎖를 무균적으로 가하고 평판을 만든다.

혐기성 난황 한천배지

Yeast Extract	5g

Tryptone	5g

Proteose Peptone	20g

Sodium Chloride	5g

Agar	20g

위의 성분을 증류수 1,000㎖에 녹여 pH 7.0으로 조정하고, 121℃에서 15분간 멸균한 후 50℃정도로 식혀 난황액(난황에 동량의 멸균생리식염수를 가한 것) 40㎖를 무균적으로 가하고 평판을 만든다.

세균수 건조필름배지

Pancreatic Digest of Casein	3.4g

Yeast Extract	2.4g

Sodium Pyruvate	6.8g

Dextrose	0.6g

Potassium Phosphate(dibasic)	1.3g

Potassium Phosphate(monobasic)	0.4g

Guar Gum(Cold water soluble gelling agent)	91.4g

2,3,5-Triphenyltetrazolium Chloride	0.0205g

(Tetrazolium indicator dye for red color reaction)

위의 성분을 증류수 1,000㎖에 녹인 후 121℃에서 15분간 멸균하여 건조필름을 제조한다.

대장균군 건조필름배지

Yeast Extract	9.6g

Pancreatic Digest of Gelatin	20.9g

Bile Salt #3	1.6g

Peptic Digest of Animal Tissue	1.6g

Lactose	21.4g

Sodium Chloride	5.3g

Crystal Violet	2㎎

Neutral Red	0.1g

Guar gum(Cold water soluble gelling agent)	65.7g

2,3,5-Triphenyltetrazolium Chloride	0.11g

위의 성분을 증류수 1,000㎖에 녹인 후 121℃에서 15분간 멸균하여 건조필름을 제조한다.

대장균 건조필름배지

Yeast Extract	9.6g

Pancreatic Digest of Gelatin	20.9g

Bile Salt #3	1.6g

Peptic Digest of Animal Tissue	1.6g

Lactose	21.4g

Sodium Chloride	5.3g

Crystal Violet	2㎎

Neutral Red	0.1g

Guar gum	65.4g

5-Bromo-4-Chloro-3-Indoxyl-beta-D-Glucuronic Acid,

Cyclohexylammonium Salt	0.2g

2,3,5-Triphenyltetrazolium Chloride	0.11g

위의 성분을 증류수 1,000㎖에 녹인 후 121℃에서 15분간 멸균하여 건조필름을 제조한다.

Peptone water

Peptone	10g

Sodium Chlroride	5g

위의 성분을 증류수 1,000㎖에 녹여 pH 7.2±0.2되도록 조정한 후 121℃에서 15분간 멸균한다.

Rappaport-Vassiliadis 배지

Tryptone	5g

NaCl	5g

KH2PO4	1.6g

Distilled water	1,000㎖

○ Magnesium Chloride solution

MgCl2․6H2O	400g

Distilled water	1,000㎖

○ Malachite Green Oxalate solution

Malachite Green Oxalate	0.4g

Distilled water	100㎖

위의 성분을 각각 제조한 후, 액체배지 1,000㎖에, 100㎖ Magnesium Chloride용액과 10㎖의 Malachite green oxalate용액을 혼합하여 시험관에 10㎖씩 분주하고 121℃에서 15분간 멸균하여 사용한다.

XLD 한천배지(Xylose Lysine Desoxycholate agar)

Yeast extract	3g

L-lysine	5g

Xylose	3.75g

Lactose	7.5g

Sucrose	7.5g

Sodium Desoxycholate	2.5g

Ferric Ammonium Citrate	0.8g

Sodium Thiosulfate	6.8g

NaCl	5g

Agar	15g

Phenol Red	0.08g

위의 성분에 증류수 1,000㎖를 가한 후 완전히 녹을 때까지 가열하고, 50℃로 식혀 멸균 페트리접시에 분주하여 사용한다. 고압증기멸균해서는 안된다.

(3) 시액

① 멸균인산완충희석액

인산2수소칼륨(KH2PO4) 34g을 증류수 500㎖에 용해하고 1N 수산화나트륨 175㎖를 가해 pH를 7.2로 조정하고 여기에 증류수를 가하여 1,000㎖로 하여 인산완충액으로 한다. 이것을 121℃에서 20분간 멸균한 다음 냉장고에 보존한다. 사용시에는 이 원액 1㎖를 취하여 멸균증류수 800㎖에 가하여 희석하고 이것을 멸균인산완충희석액으로 한다.

② 멸균생리식염수

Sodium Chloride 8.5g에 증류수를 가하여 1,000㎖로 하고 15파운드(121℃)로 15분간 고압 증기 멸균한다.

③ 뉴-만 염색액

테트라클로로에탄(Tetrachloroethane) 40㎖와 에탄올(Ethanol)을 삼각플라스크에 취하고 70℃까지 가온한 후 여기에 메틸렌블루(Methylen blue) 1.0～2.0g을 가하여 세게 진탕 혼합하여 색소를 용해시킨 다음 냉각시킨다. 여기에 빙초산 6㎖를 천천히 가한 후 여과시켜 냉암소에 밀봉 저장한다. 염색액을 조제하여 시일이 경과한 것이나 또는 침전물이 생성된 것은 사용해서는 안된다.

④ BTB-MR 지시약

Brom Thymol Blue 0.2g과 Methyl Red 0.1g을 95% 에탄올 300㎖에 용해한 후 정제수 200㎖와 혼합한다.

⑤ 젤라틴 인산완충액

Gelatin 2g과 Disodium Phosphate 4g을 증류수 1,000㎖에 녹여 pH를 6.2로 조정한 후 121℃에서 15분간 멸균한다.

⑥ Nitrite 지시약

․A시약 : Sulfanilic acid 1g에 5N acetic acid 125㎖를 가하여 제조한다.

․B시약 : N-(1-naphthyl)ethylene dihydrochloride 0.25g에 5N acetic acid 200㎖를 가하여 제조한다.

5N acetic acid는 28.75㎖의 빙초산(glacial acetic acid)에 증류수 71.25㎖를 가하여 제조한다.

사용시 0.5㎖ A시약과 0.2㎖ B시약을 각 각 반응액에 첨가하여 적색-보라색을 띄면 양성으로 판정하며, 만일 반응이 없으면 Zn을 소량 첨가하여 색의 변화가 없으면 이를 양성으로 판정한다.

2) 세균수(일반세균수)

(1) 표준 평판법

표준평판균수는 검체 중에 존재하는 세균 중 표준한천배지내에서 발육할 수 있는 중온균의 수를 말한다. 수질검사시에는 이 균수를 일반세균수라고 부른다. 특히 이 방법은 보통 검체와 표준한천배지를 페트리접시 중에서 혼합 응고시켜 배양 후 발생한 세균의 집락수로 부터 검체중의 생균수를 산출하는 방법이다.

① 시험조작

1) 일반사항 (1) 검체의 채취 및 취급 ②의 시험용액 1㎖와 각 단계 희석액 1㎖씩을 멸균 페트리접시 2매 이상씩에 무균적으로 취하여 약 43～45℃로 유지한 표준한천배지(배지 1) 약 15㎖를 무균적으로 분주하고 페트리접시 뚜껑에 부착하지 않도록 주의하면서 조용히 회전하여 좌우로 기울이면서 검체와 배지를 잘 섞고 냉각 응고시킨다.

특히 확산집락의 발생을 억제하기 위해서는 다시 표준한천배지 3～5㎖를 가하여 중첩시킨다. 이 경우 검체를 취하여 배지를 가할 때까지의 시간은 20분 이상 경과하여서는 안된다. 냉각 응고시킨 페트리접시는 거꾸로 하여 35±1℃에서 24～48시간(검체에 따라서는 35℃에서 72±3시간) 배양한다. 이 때 대조시험으로 검액을 가하지 아니한 동일 희석액 1㎖를 배지에 가한 것을 대조로 하여 페트리접시, 희석용액, 배지 및 조작이 무균적이었는지의 여부를 확인한다. 또한 배지는 배양 중에 그 중량이 15%이상 감소되어서는 아니 된다. 시험에 사용하는 페트리접시는 지름 9～10㎝, 높이 1.5㎝의 것을 사용한다. 배양 후 즉시 집락 계산기를 사용하여 생성된 집락수를 계산한다. 부득이할 경우에는 5℃에 보존시켜 24시간 이내에 산정한다. 집락수의 계산은 확산 집락이 없고(전면의 1/2이하 일 때에는 지장이 없음) 1평판당 30～300개의 집락을 생성한 평판을 택하여 집락수를 계산하는 것을 원칙으로 한다. 전 평판에 300개 이상 집락이 발생한 경우 300에 가까운 평판에 대하여 밀집평판 측정법에 따라 안지름 9㎝의 페트리접시인 경우에는 1㎝2내의 평균집락수에 65를 곱하여 그 평판의 집락수로 계산한다. 전 평판에 30개 이하의 집락만을 얻었을 경우에는 가장 희석배수가 얕은 것을 측정한다.

② 세균수의 기재보고

표준평판법에 있어서 검체 1㎖ 중의 세균수를 기재 또는 보고할 경우에 그것이 어떤 제한된 것에서 발육한 집락을 측정한 수치인 것을 명확히 하기 위하여 1평판에 있어서의 집락수는 상당 희석배수로 곱하고 그 수치가 표준평판법에 있어서 1㎖ 중(1g 중)의 세균수 몇개라고 기재보고하며 동시에 배양온도를 기록한다. 이 산출법에 의하지 않을 때에는 “표준”이란 문자를 사용해서는 아니 된다. 숫자는 높은 단위로부터 3단계를 4사5입하여 유효숫자를 2단계로 끊어 이하를 0으로 한다.

(2) 건조필름법

① 시험조작

1) 일반사항 (1) 검체의 채취 및 취급 ②의 시험용액 1㎖와 각 단계 희석액 1㎖를 세균수 건조필름배지(배지 53)에 접종한 후 잘 흡수시키고 35±1℃에서 24～48시간 배양한 후 생성된 붉은 집락수를 계산하고 그 평균집락수에 희석배수를 곱하여 일반세균수로 한다.

3) 저온세균수

저온세균수는 보통 20～25℃의 저온에서 비교적 신속하게 발육하는 세균을 말한다.

① 시험조작

2) 세균수의 (1) 표준평판법에 준한다. 그러나 배양온도는 25±1℃에서 72±3시간 배양하여 발육한 집락의 수를 측정하여 저온세균수로 한다.

4) 내열성세균수(세균아포수)

내열성 세균수는 다음의 처리 및 배양조건에서 발생한 호기성 아포형균의 집락수로부터 산출된 수를 말한다.

① 시험조작

위의 1) 일반사항 (1) 검체의 채취 및 취급 ② 시험용액의 조제에 따라 조제한 시험원액 20㎖를 멸균중형시험관(18×170㎜)에 넣고 끓는 물속에 10분간 넣어 가열한 후 위의 표준평판법에 준한다. 그러나 배양은 35±1℃에서 48±3시간 배양하여 발육한 집락의 수를 측정하여 내열성세균수로 한다.

5) 대장균군

대장균군이라 함은 Gram음성, 무아포성 간균으로서 유당을 분해하여 가스를 발생하는 모든 호기성 또는 통성 혐기성세균을 말한다. 대장균군 시험에는 대장균군의 유무를 검사하는 정성시험과 대장균군의 수를 산출하는 정량시험이 있다.

(1) 정성시험

① 유당배지법

대장균군의 정성시험은 추정시험, 확정시험, 완전시험의 3단계로 나눈다. 1) 일반사항 (1) 검체의 채취 및 취급 ②의 시험용액 10㎖를 2배 농도의 유당배지(배지 2)에, 시험용액 1㎖ 및 0.1㎖를 유당배지(배지 2)에 각각 3개 이상씩 가한다.

㉮ 추정시험

유당배지를 가한 발효관에 검체를 넣어 35±1℃에서 48±3시간 동안 배양하여 가스 발생이 있으면 대장균군의 존재가 추정된다. 시험에 사용하는 발효관은 듀람(Durham)발효관 또는 스미스(Smith)발효관으로서 희석액을 가하여 유당배지의 농도가 되도록 한다. 즉, 검액을 10, 1, 0.1㎖씩 접종하여 35±1℃에서 24±2시간 배양하여 발효관 내에 가스가 발생하면 추정시험 양성이고 만약 24±2시간 내에 가스가 발생하지 아니하였을 때에는 더 배양을 계속하여 48±3시간까지 관찰한다. 이 때까지 가스가 발생하지 않았을 때에는 추정시험 음성이고 가스발생이 있을 때에는 추정시험 양성이며 다음의 확정시험을 실시한다.

㉯ 확정시험

추정시험에서 가스발생이 있는 발효관으로부터 BGLB배지(배지 3)에 이식하여 35±1℃에서 48±3시간 동안 배양하였을 때에 가스발생을 보인 BGLB배지로부터 Endo 평판배지 또는 EMB 한천평판배지(배지 6)에 분리 배양한다. 평판배양의 경우에는 35±1℃에서 24±2시간 배양 후 전형적인 집락이 발생되면 확정시험 양성으로 한다. BGLB배지에서 35±1℃로 48±3시간 동안 배양하였을 때 배지의 색이 갈색으로 되었을 때에는 완전시험을 하지 않으면 안된다.

㉰ 완전시험

대장균군의 존재를 완전히 증명하기 위하여 위의 평판상의 집락이 그람음성, 무아포성의 간균임을 확인하고, 유당을 분해하여 가스의 발생 여부를 재확인한다. 확정시험 때 Endo 평판배지나 EMB 평판배지상에서 전형적인 집락을 인정하였을 때에는 1개 또는 비전형적인 집락일 경우에는 2개 이상을 따서 각각 유당부이온발효관과 보통한천사면배지(배지 8)에 이식하여 35±1℃에서 48±3시간동안 배양한다. 이때 가스를 발생한 발효관에 해당되는 한천사면배지의 집락에 대하여 그람염색을 실시하였을 때에 그람음성, 무아포성 간균이 증명되면 완전시험은 양성이며 대장균군 양성으로 판정한다.

② BGLB 배지법

1) 일반사항 (1) 검체의 채취 및 취급 ②의 시험용액 1～0.1㎖를 2개의 BGLB 발효관에 가한다.

㉮ 정성시험

검체는 필요에 따라 적당한 전처리를 하고 희석시 그 1～0.1㎖를 2개씩 BGLB발효관에 가한다. 대량의 검체를 가할 필요가 있을 때에는 대량의 배지를 넣은 발효관을 사용한다. 검체를 가한 배지는 35±1℃에서 48±3시간까지 관찰하고 가스의 발생을 인정하였을 때에는(배지를 흔들 때 거품 모양의 가스의 존재를 인정하였을 때에도) EMB평판배지 또는 Endo평판배지에 획선 도말하고 분리 배양한다. 이하의 조작은 유당부이온을 사용한 시험법의 확정시험 또는 완전시험 때와 같이 행하고 대장균군의 유무를 시험한다.

③ 데스옥시콜레이트 유당한천 배지법

㉮ 정성시험

1) 일반사항 (1) 검체의 채취 및 취급 ②의 시험용액 1㎖와 각 단계 희석액 1㎖씩을 2매이상의 멸균 페트리접시에 취하고 미리 가온 용해하여 약 50℃에 보존한 데스옥시콜레이트유당한천배지(배지 9) 약 15㎖를 무균적으로 분주하고 페트리접시 뚜껑에 부착하지 않도록 주의하면서 조용히 회전하여 좌우로 기울이면서 검체와 배지를 잘 혼합한 후 냉각응고 시킨다. 그리고 그 표면에 동일한 배지 또는 보통한천배지를 3～5㎖를 가하여 중첩시킨다. 이것을 35±1℃에서 20±2시간 배양하여 전형적인 암적색의 집락을 인정하였을 때에는 1개 이상의 집락을, 의심스러운 집락일 경우에는 2개 이상을 EMB평판배지 또는 Endo평판배지에서 분리 배양한다. 이것을 35±1℃에서 24±2시간 배양한다. 이하의 조작은 유당부이온의 확정시험 및 완전시험법에 따라 실시하고 대장균군의 유무를 결정한다.

(2) 정량시험

① 최확수법

최확수법이란 수단계의 연속한 동일희석도의 검체를 수개씩 유당부이온발효관에 접종하여 대장균군의 존재 여부를 시험하고 그 결과로부터 확률론적인 대장균군의 수치를 산출하여 이것을 최확수(MPN)로 표시하는 방법이다. 최확수(표 7-1)는 검체 10, 1 및 0.1㎖씩을 각각 5개씩 또는 3개씩의 발효관에 가하여 배양 후 얻은 결과에 의하여 검체 100㎖중 또는 100g중에 존재하는 대장균군수를 표시하는 것이다. 최확수란 이론상 가장 가능한 수치를 말한다.

㉮ 시험조작

대장균군의 정량시험에는 희석검체(0.1㎖이하의 경우에는 10배수 희석액 1㎖씩을 사용한다) 10, 1, 0.1, 0.01㎖와 같이 연속해서 4단계 이상을 5개 또는 3개씩의 유당부이온발효관에 접종시킨다. 이 때 검체의 최대량을 가한 발효관의 대다수 또는 전부에서 가스를 발생하고 최소량을 접종한 발효관의 전부 또는 대다수가 가스를 발생하지 않도록 적당히 희석하고 사용한다. 가스발생 발효관 각각에 대하여 추정, 확정, 완전시험을 행하고 대장균군의 유무를 확인한 다음 최확수표로부터 검체 100㎖중의 최확수를 구한다. 예로서 대장균군의 최확수법에 의한 정량시험에 의하여 검체 또는 희석검체의 각각의 발효관을 5개씩 사용하여 다음과 같은 결과를 얻었다면

검체접종량 가스양성관수	10㎖ 5 개	1㎖ 3 개	0.1㎖ 1 개

최확수표에 의한 검체 100㎖중의 MPN은 110으로 된다.

이 때 검체접종량이 1, 0.1, 0.01㎖일 때에는 110×10＝1,100으로 한다.

검체의 접종이 3단계 이상으로 행하여졌을 때에는 다음 표와 같이 취급한다. 이 때의 숫자는 양성관수,  ○내의 숫자는 유효숫자이다.

접종량 예	1 ㎖	0.1㎖	0.01㎖	0.001㎖
Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ	5 ⑤ □ ( 5 ⑤	⑤ ④ ① 3 ③	② ③ □ 1 ②	□ 0 0 1 )

예 Ⅰ, Ⅱ：5개 양성을 표시한 최소 접종량으로부터 시작한다.

예 Ⅲ：양성을 인정한 접종량을 중간으로 한다.

예 Ⅳ：최소유효 접종량(이 경우는 0.01㎖)보다 1단계 적은 접종량(0.001㎖)일 때에는 양성관을 인정할 경우 최초 접종량에 의한 양성관수(이 경우 1)를 상단위에 가한다. 즉, 접종량 0.01㎖ 양성관수 1에 접종량 0.001㎖의 양성관수를 가하여 2로 한다.

[최확수표]

표 7-1에 의하여 또 3개씩 접종했을 때에는 위 5개 법에 준하여 표 7-2에 따라 최확수를 구한다.

② BGLB 배지에 의한 정량법

시험용액 10, 1 또는 0.1㎖를 5개씩의 BGLB 배지에 접종한다. 0.1㎖ 이하를 접종할 필요가 있을 때에는 10배 희석단계액을 각각 1㎖씩 사용한다. 이 때에 시험용액의 최대량을 가한 배지의 전부 또는 대부분에서 가스발생을 인정하고 최소량을 가한 배지의 전부 또는 대부분이 가스를 발생하지 않도록 접종량과 희석도를 고려하여야 한다. 이하의 조작은 각 발효관에 대하여 BGLB 배지에 의한 정성시험법에 따라 하고 대장균군의 유무를 조사하여 최확수표에 따라 검체 100㎖ 또는 100g중의 대장균군수를 산출한다.

③ 데스옥시콜레이트유당한천배지에 의한 정량법

1) 일반사항 (1) 검체의 채취 및 취급 ②의 시험용액 1㎖와 각 단계 희석액 1㎖에 대하여 이 배지에 의한 정성시험법과 같은 조작으로 35±1℃에서 20±2시간 배양한 후 생성된 집락 중 전형적인 집락 또는 의심스러운 집락에 대하여 정성시험 때와 같은 조작으로 대장균군의 유무를 결정한다. 균수 산출은 세균수(일반세균수)측정법에 따라 한다.

④ 건조필름법

1) 일반사항 (1) 검체의 채취 및 취급 ②의 시험용액 1㎖와 각 단계 희석액 1㎖를 대장균군 건조필름배지(배지 54)에 접종한 후 잘 흡수시키고, 35±1℃에서 24±2시간 배양한 후 생성된 붉은 집락 중 주위에 기포를 형성하고 있는 집락수를 계산하고, 그 평균집락수에 희석배수를 곱하여 대장균군 수를 산출한다.

6) 대장균

검체의 종류에 따라 대장균의 검출이 대장균군보다 정확한 오염지표가 되는 경우가 있다. 대장균의 시험법에는 최확수법에 의한 정량시험과 일정한 한도까지 균수를 정성으로 측정하는 한도시험법이 있다.

표 7-1. 대장균군시험의 최확수표 다음의 희석과 시험관수에 의한 양성수에 대한 최확수와 95%의 신뢰한계 A—10㎖씩 5개 B—10㎖씩 5개, 1㎖씩 5개, 0.1㎖씩 5개

양 성 관 수			MPN 10㎖	MPN의 신뢰한계		B			MPN 100㎖	MPN의 신뢰한계
A						10㎖씩5개	1㎖씩 5개	0.1㎖씩 5개
10㎖씩 5개				하한	상한					하한	상한
0 1 2 3 4 5			〈2.2 2.2 5.1 9.2 16 〉16	0 0.1 0.5 1.6 3.3 8.0	6.0 12.6 19.2 29.4 52.9 ∞	1 1 1 1 1 1	0 0 1 1 1 2	2 3 0 1 2 0	6 8 4 6 8 6	〈0.5 1 〈0.5 〈0.5 1 〈0.5	15 19 11 15 19 15
B				MPN의 신뢰한계		1 1 1	2 2 3	1 2 0	8 10 8	1 2 1	19 23 19
10㎖씩 5개	1㎖씩 5개	0.1㎖씩 5개	MPN 100㎖
				하한	상한
0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 2 2 2 2 3	0 0 1 1 1 2 2 3 0 0 2 3 3 4 0	1 2 0 1 2 0 1 0 0 1 2 0 1 0 0	2 4 2 4 6 4 6 6 2 4 14 12 14 15 8	〈0.5 〈0.5 〈0.5 〈0.5 〈0.5 〈0.5 〈0.5 〈0.5 〈0.5 〈0.5 4 3 4 4 1	7 11 7 11 15 11 15 15 7 11 34 28 34 37 19	1 1 2 2 2 2 2 2 2 2 2 4 5 5 5 5	3 4 0 0 0 0 1 1 1 2 2 5 0 0 0 0	1 0 0 1 2 3 0 1 2 0 1 1 0 1 2 3	10 11 5 7 9 12 7 9 12 9 12 48 23 31 43 58	2 2 〈0.5 1 2 3 1 2 3 2 3 16 7 11 15 19	23 25 13 17 21 28 17 21 28 21 28 124 70 89 114 144

표 7-2. 3단계희석(10, 1, 0.1㎖)시험관 3개씩 시험하였을 때의 양성에 대한 최확수와 95%의 신뢰한계

양 성 관 수			MPN 100㎖	MPN의 신뢰한계		B			MPN 100㎖	MPN의 신뢰한계
10㎖씩 3개	1㎖씩 3개	0.1㎖씩 3개				10㎖씩 3개	1㎖씩 3개	0.1㎖씩 3개
				하한	상한					하한	상한
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1	0 0 0 0 1 1 1 1 2 2 2 2 3 3 3 3 0 0 0 0 1 1 1 1 2 2 2 2 3 3 3 3	0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3	3 6 9 3 6.1 9.2 12 6.2 9.3 12 16 9.4 13 16 19 3.6 7.2 11 15 7.3 11 15 19 11 15 20 24 16 20 24 29	0 0.085 0.085 0.87 0.88 2.7	9 13 20 21 23 36	2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3	0 0 0 0 1 1 1 1 2 2 2 2 3 3 3 3 0 0 0 0 1 1 1 1 2 2 2 2 3 3 3 3	0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3	9.1 14 20 26 15 20 27 34 21 28 35 42 29 36 44 53 23 39 64 95 43 75 120 160 93 150 210 290 240 460 1,100 22,400	1.0 2.7 2.8 3.5 3.5 6.9 7.1 14 30 15 30 35 36 71 150 460	36 37 44 47 120 130 210 230 380 380 440 470 1,300 2,400 4,800

(1) 최확수법

B			MPN 100㎖	MPN의 신뢰한계		B			MPN 100㎖	MPN의 신뢰한계
10㎖씩 5개	1㎖씩 5개	0.1㎖씩 5개				10㎖씩 5개	1㎖씩 5개	0.1㎖씩 5개
				하한	상한					하한	상한
3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4	0 0 1 1 1 1 2 2 2 3 3 4 4 5 0 0 0 0 1 1 1 2 2 2 3 3 3 4 4 5	1 2 0 1 2 3 0 1 2 0 1 0 1 0 0 1 2 3 0 1 2 0 1 2 0 1 2 0 1 0	11 13 11 14 17 20 14 17 20 17 21 21 14 25 13 17 21 25 17 21 26 22 26 32 27 33 39 34 40 41	2 3 2 4 5 6 4 5 6 5 7 7 8 8 3 4 7 8 5 7 9 7 9 11 9 11 13 12 14 14	25 31 25 34 46 60 34 46 60 46 63 63 72 75 31 46 63 75 46 63 78 67 78 91 80 93 106 96 108 110	5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5	0 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 3 3 3 3 3 3 4 4 4 4 4 4 5 5 5 5 5 5	4 0 1 2 3 0 1 2 3 4 5 0 1 2 3 4 5 0 1 2 3 4 5 0 1 2 3 4 5	76 33 46 63 84 49 70 94 120 148 177 79 109 141 175 212 253 130 172 221 278 345 426 240 348 542 920 1,600 22,400	24 11 16 21 26 17 23 28 33 38 44 25 31 37 44 53 77 35 43 57 90 117 145 68 118 180 300 640 800	180 93 120 154 197 126 168 219 281 366 515 187 253 343 503 669 788 302 486 698 849 999 1,161 754 1,005 1,405 3,200 5,800 ∞

1) 일반사항 (1) 검체의 채취 및 취급 ②의 시험용액 10㎖, 1㎖ 및 0.1㎖를 각각 5개 또는 3개의 EC 배지(배지 10) 발효관에 접종한 다음 44.5±0.2℃ 항온수조에서 24±2시간 배양한다. 다만 시험용액 10㎖를 첨가할 경우 배농도의 배지 10㎖를 이용한다. 그때에 가스발생을 인정한 발효관을 대장균(E.coli) 양성이라고 판정한다. 이 양성관으로 부터 표 7-1 또는 표 7-2 최확수표에 따라 검체 100g(또는 100㎖)중의 대장균수를 산출한다.

(2) 한도시험

1) 일반시험 (1) 검체의 채취 및 취급 ②의 시험용액 1㎖를 3개의 EC 배지에 접종하고 44.5±0.2℃에서 24±2시간 배양한다. 이 때에 가스발생을 인정한 발효관은 추정시험 양성으로 하고 가스발생이 인정되지 않을 때에는 추정시험 음성으로 한다.

추정시험이 양성일 때에는 해당 EC발효관으로부터 1백금이를   EMB 평판배지에 획선 접종하여 35±1℃에서 24±2시간 배양한 후 전형적 집락을 취하여 유당배지 및 보통한천사면배지에 각각 이식한다. 유당배지에 접종한 것은 35±1℃에서 48±3시간 배양하고 보통한천사면배지에 접종한 것은 35±1℃에서 24±2시간 배양한다. 유당배지에서 가스발생을 인정하였을 때에는 이에 해당하는 보통한천사면배지에서 배양된 집락을 취하여 그람염색을 실시하고 검경 후 그람음성, 무아포성 간균을 확인한 후 생화학 시험을 실시하여 대장균 양성으로 판정한다.

(3) 건조필름법

1) 일반사항 (1) 검체의 채취 및 취급 ②의 시험용액 1㎖와 각 단계 희석액 1㎖를 대장균 건조필름배지(배지 55)에 접종한 후 잘 흡수시키고, 35±1℃에서 24～48시간 배양한 후 생성된 푸른 집락 중 주위에 기포를 형성하고 있는 집락수를 계산하고 그 평균집락수에 희석배수를 곱하여 대장균수를 산출한다.

7) 총균수

일정량의 검체를 슬라이드그라스위에 일정면적으로 도말하고 건조시켜 염색한 후 현미경으로 검경하고 염색된 세균수를 측정한다. 측정된 세균수를 현미경 시야 면적과의 관계에 따라 검체 중에 존재하는 세균수를 측정하는 방법이다.

(1) 시험조작

① 표본제작

검체를 그 용기와 같이 25회 이상 잘 흔들어 우유세균검사용 마이크로피펫으로 검액 적당량을 흡입시키고 백포(백색헝겊)로 피펫 외벽에 부착한 우유를 깨끗이 씻은 다음 피펫내의 우유를 그 선단으로부터 백포를 사용하여 흡인시키면서 정확히 0.01㎖로하고 그 전부를 슬라이드그라스 위에 방출하고 도말침을 사용하여 1㎝2 면적에 도말하고 약 5분간 가온하여 건조시킨 다음, 뉴만 염색액(시액 3)중에 순간적으로 적셔서 염색하고 남은 액을 즉시 흔들어 떨어뜨린 다음 건조시켜 물로 씻고 다시 건조시켜 표본을 만든다.

② 측정

유침렌즈를 장치한 현미경을 미리 대물측미계를 사용하여 시야의 직경을 0.206㎜로 조절하고 여기에 위에서 제작한 표본을 장착하고 그 도말면의 중심을 통과하는 직선상의 등간격의 16시야에 모든 세균수를 측정하고 1시야 중에 대한 평균수를 구한다.

여기에 30만을 곱한 수의 첫째자리 숫자로부터 3째 단위를 4사5입하고 상위 2단위 수로 표시한다. 1시야에 나타난 세균의 수를 측정하는 방법은 다음과 같다.

㉮ 개체법

1시야에 나타난 세균이 균괴를 형성하였을 때 그것이 쌍쌍을 이루고 있거나 연쇄상을 이루고 있는 세균은 1개씩 측정한다. 균괴로 되어 있을 때에는 개개의 균을 눈으로 보아 균을 구별할 수 없을 때에는 1개로 측정한다.

㉯ 균괴법(Group Count)

1시야에 나타난 세균이나 균괴를 형성하고 있을 때 즉, 쌍쌍 또는 연쇄균괴를 형성하고 있을 때에는 각각 1군을 1개로 계산한다. 그러나 옆에 인접한 균 또는 균괴가 최소의 균경(균의 지름)에 2배 이상 떨어져 있을 때에는 별도균의 Clamp로 측정한다. 따라서 떨어져 있는 1개의 균은 Clamp로서 측정하는 것으로 한다.

8) 유산균수

이 시험은 유산균수를 측정하기 위하여 실시한다. 유산균수의 측정방법은 2) 세균수(일반세균수)측정방법에 준하여 시험하고 검체의 희석액은 멸균생리식염수를 사용한다. 다만, 배지는 BCP첨가 평판측정용배지(배지 11)을 사용하여 35～37℃에서 72±3시간 배양한 후 발생한 황색의 집락을 유산균의 집락으로 계측한다.

(1) 유산간균 및 구균

유산균수의 측정방법은 2) 세균수(일반세균수) 측정방법에 준하여 시험하되 검체의 희석액은 멸균생리식염수를 사용한다. 다만, 배지는 BCP첨가 평판측정용배지(배지 11)를 사용하여 35～37℃에서 72±3시간 배양한 후 발생한 황색의 집락을 유산균의 집락으로 계측한다.

(2) 비피더스균(Bifidobacterium)

① 검체 1g에 10% 탈지분유 희석액 또는 생리식염수를 가하여 100㎖가 되게 한 다음 잘 혼합한다.

② ①의 검액(10-2용액) 1㎖에 희석액을 가하여 10㎖가 되게 하고 10-3 검액을 만든 후

동일하게 조작하여 10-4, 10-5, 10-6, 10-7 검액을 조제한다.

③ 각 희석검액 0.1㎖씩을 각각 BL한천배지(배지 15)상에 접종하여 멸균초자봉으로 도포한다.

④ 배지를 혐기성 상자에 넣고 37℃에서 48～72시간 배양한다. 배양 후 군집을 계수하고 희석배수(×10)를 곱하여 검체 g당 생균수를 산출한다. 단, 1평판당 30～300개 집락의 희석검체만 측정한다. 또, 집락수가 1평판당 30～300개의 범위에 있는 희석검체가 없는 경우에는 희석배수를 변경하여 다시 측정한다.

⑤ 배양후 BL한천평판상의 균의 성장

㉮ Bifidobacterium longum

유갈색～황갈색의 반구상으로 융기된 중심부가 적갈색인 직경 약 1.0～2.0㎜의 집락을 형성한다.

㉯ Bifidobacterium bifidum

유갈색～회색으로 융기된 중심부가 적갈색인 직경 0.5～1.5㎜정도의 원형집락을 형성한다.

㉰ Bifidobacterium breve

유백색～유갈색의 반구형으로 중심부가 융기된 직경 1.0～2.0㎜의 원형 집락을 형성한다.

(3) 유산균과 비피더스균의 혼합제품

(1) 유산균수와 (2) 비피더스균의 시험방법에 따라 시험한 후 유산균수와 비피더스균수를 합하여 산출한다. 단, 이때에 비피더스균의 시험시에는 BS배지(배지 25)를 사용한다.

9) 진균수(효모 및 사상균수)

진균수의 측정방법은 2) 세균수(일반세균수) 측정방법에 준하여 시험한다. 다만, 배지는 포테이토 덱스트로오즈 한천배지(배지 12)를 사용하여 25℃에서 5～7일간 배양한 후 발생한 집락수를 계산하고 그 평균집락수에 희석배수를 곱하여 진균수로 한다.

10) 탄저균(Bacillus anthracis)

육 및 육제품의 경우, 그 유제를 만들어 식염을 첨가하지 않은 보통한천배지(배지 8)에 도말하여 37℃에서 24시간 배양한다. 탄저균은 그의 특이한 회백색의 축모상 혹은 곰보 유리모양의 집락을 형성하며 혈액한천배지에서는 용혈성이 없고 액체배지에서는 침전하여 발육하며 상층부는 투명하고 균막을 형성하지 않는다. 이를 도말하여 염색하면 그람양성의 대간균으로서 양단이 직각으로 잘려져 있고 낚싯대 모양의 연쇄상을 나타낸다. 상기의 유제를 신선한 경우는 그대로, 그렇지 않은 경우는 80℃에서 30분간 가열한 후 guinea pig(250～300g체중)의 복강내에 0.5～1.0㎖를 접종하면 양성인 경우 24시간 후에 접종부위에 부종이 생기고 점차 복부내에 퍼져 수일 후에 폐사한다. 이를 해부하여 병리학적 소견을 관찰하고 도말하여 검경한 후 다시 균을 분리 동정한다.

11) 결핵균

우유와 같은 액상의 시료는 약 30㎖이상을 3,000rpm에서 30분간 원심분리하여 유지부를 시험관에 취하고 침전물에서 1백금이를 취하여 도말표본을 만들고 Ziehl Neelsen법으로 항산성 염색하여 검경한다. 유지부에는 이와 동량의 8% NaOH액을 침전물에는 그의 약 10배양의 4% NaOH액을 가하여 잘 혼합한 후 각각 0.1㎖씩을 3% Okawa 배지(배지 24)에 적하하고 37℃의 부란기내에서 배지를 옆으로 눕혀두고 대부분의 검액이 흡수되기를 기다렸다가 배지의 시험관을 밀전하여 2개월간 배양을 계속하면서 때때로 균 집락의 발생을 관찰한다. 배양하고 남은 위의 시료는 BTB를 가한 염산 수용액을 적하하여 중화시킨 후 1～2㎖씩을 guinea pig의 피내에 접종한다. 여기에 쓰는 guinea pig는 Tuberculin 반응 음성인 것으로서 체중 300g 이상인 것을 사용하며, 접종 후 2주간부터 가끔 Tuberculin 반응과 체중을 조사한다.

결핵균에 감염을 받은 경우에는 보통 2～5주간부터 양성으로 되고 체중은 점차로 감소하며 접종국소에 경결 또는 괴양이 생기며 국소 임파절이 종창한다. 4～8주 후에 guinea pig를 죽이고 부검하여 임파절 및 각 장기의 결핵성 변화를 관찰한다. 병변 부위의 장기를 무균적으로 채취하여 1% NaOH로 유제를 만들고 그 0.1㎖씩을 1% Okawa배지에 배양하여 다시 결핵균을 확인한다.

12) 브루셀라(Brucella)

우유의 경우는 20～30㎖를 3,000rpm으로 30분간 원심분리하여 유지부와 침전물을 아래의 배양법에 의하여 직접도말 배양하고 두 마리 이상의 guinea pig(250～300g 체중)에 3～5㎖씩을 복강내에 세 마리 이상의 마우스(12～15g)의 피하에 0.25～0.5㎖를 주사한다. 고체시료는 그 유제를 조제하여 직접도말 배양하고 위의 실험동물에 주사하거나, 유제를 멸균 가제로 여과한 후 그 여액 또는 1,000rpm에서 5분간 원심분리하여 얻은 상층액을 실험동물에 접종한다. 이 균의 분리용 배지는 Liver agar(배지 26)평판배지를 사용하나 만약 시료가 잡균에 의하여 오염되어 있다고 인정될 때는 Liver agar에 그 중량의 20만분의 1에 해당하는 젠치안 바이오렛을 첨가하여 10% 탄산가스 조건하에 37℃에서 4～6일간 배양한다. 이 때 형성된 집락은 소원형으로서 다소 융기되어 있고 투명한 빛깔이 있으며 착색되어 있지 않으나 시일이 경과된 집락은 약간 불투명하고 갈색을 띤 회백색을 보인다. 염색하여 검경하면 그람음성의 단간균으로서 구균처럼 보인다. 액체배지에서 37℃로 24시간 배양하면 균이 혼탁하게 발육하고 10일 이상 경과하면 더욱 혼탁하여지면서 적조한 균괴가 균막과 같이 표면으로부터 관벽에 엉긴다. 이 균은 운동성이 없으며 당류도 거의 분해하지 않고 Indole 반응, MR반응 및 VP반응이 음성이다. 상기의 실험동물에 주사한 것은 접종 3주후에 실험동물의 혈청에서 이 균에 대한 항체가 형성되었는지 여부를 혈청학적으로 진단하고 비장에서 본 균을 분리 배양한다.

13) 살모넬라(Salmonella spp.)

(1) 증균배양

검체 25g 또는 25㎖를 취하여 225㎖의 peptone water(배지 56)에 가한 후 35℃에서 18±2시간 증균배양 한다. 배양액 0.1㎖를 취하여 10㎖의 Rappaport-Vassiliadis배지(배지 57)에 접종하여 42℃에서 24±2시간 배양한다.

(2) 분리배양

증균배양액을 MacConkey 한천배지(배지 30) 또는 Desoxycholate Citrate 한천배지(배지 31) 또는 XLD한천배지(배지 58)에 접종하여 35℃에서 24시간 배양한 후, 의심되는 집락은 확인시험을 실시한다.

(3) 확인시험

① 생화학적 확인시험

분리배양된 평판배지상의 집락을 보통한천배지(배지 8)에 옮겨 35℃에서 18～24시간 배양한 후, TSI 사면배지(배지 32)의 사면과 고층부에 접종하고 35℃에서 18～24시간 배양하여 생물학적 성상을 검사한다. 살모넬라는 유당, 서당 비분해(사면부 적색), 가스생성(균열 확인) 양성인 균에 대하여 그람음성 간균임을 확인하고 urease 음성, lysine decarboxylase 양성 등의 특성을 확인한다.

② 응집시험

Spicer-Edwards등과 같은 H 혼합혈청과 O 혼합혈청을 사용하여 응집반응을 확인한다.

14) 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)

(1) 증균배양

검체 25g 또는 25㎖를 취하여 225㎖의 10% NaCl을 첨가한 TSB배지(배지 23)에 가한 후 35～37℃에서 16시간 증균 배양한다.

(2) 분리배양

증균배양액을 난황첨가 만니톨 식염한천배지(배지 14)에 접종하여 37℃에서 16～24시간 배양한다. 배양결과 난황첨가 만니톨 식염한천배지에서 황색 불투명 집락(만니톨분해)을 나타내고 주변에 혼탁한 백색환(난황반응 양성)이 있는 집락은 확인시험을 실시한다.

(3) 확인시험

분리배양된 평판배지상의 집락을 보통한천배지(배지 8)에 옮겨 37℃에서 18～24시간 배양한 후 그람염색을 실시하여 포도상의 배열을 갖는 그람양성 구균을 확인한다. 포도상의 배열을 갖는 그람양성구균이 확인된 것은 coagulase 시험을 실시한다. 토끼혈청(신선혈청은 5%, 건조혈청의 용액은 10%)을 가한 생리식염수를 멸균한 시험관에 0.5～1㎖씩 무균적으로 분주한다. 여기에 분리배지상의 집락에서 직접 또는 보통한천배지에서 순수 배양시킨 균 1백금이를 접종하여 37℃에서 배양한다. 배양 후 3, 6, 24시간의 각 시간에 응고의 유무를 판정하여 어느 시간 후에도 응고 또는 섬유소(fibrin)가 석출된 것은 모두 coagulase 양성으로 하며 이상과 같이 확인된 것은 황색포도상구균 양성으로 판정한다.

시험에 있어서는 coagulase 양성균 및 균주접종의 음성대조균을 둔다.

15) 장염비브리오(Vibrio parahaemolyticus)

(1) 증균배양

검체 25g 또는 25㎖를 취하여 225㎖의 펩톤수(배지 16) 10㎖에 가한 후 35℃에서 18～24시간 증균 배양한다.

(2) 분리배양

증균배양액을 TCBS한천배지(배지 17)에 접종하여 35℃에서 18～24시간 배양한다. 배양결과 직경 2～4㎜인 청록색의 서당 비분해 집락에 대하여 확인시험을 실시한다.

(3) 확인시험

분리배양된 평판배지상의 집락을 TSI사면배지(배지 32), LIM배지(배지 18), 보통한천배지(배지 8)에 각각 접종한 후 35℃에서 18～24시간 배양한다. 장염비브리오는 TSI사면배지에서 사면부가 적색(유당, 서당 비분해), 고층부는 황색(포도당발효), 가스 비생성, 유당 및 서당 비분해(사면부가 적색), 황화수소 비생성(고층부가 흑색화되지 않음), LIM배지에서 Lysine Decarboxylase 양성, Indole 생성, 운동성 양성, Oxidase시험 양성이다. 위 시험에서 장염비브리오로 추정된 균은 0, 3, 8 및 10% NaCl을 가한 Peptone수(배지 16)에 의한 내염성시험, VP 시험(배지 19), Mannitol 이용성시험(배지 20, 1% Mannitol 첨가), Arginine 및 Ornithine 분해시험(배지 21, 1% Arginine 또는 1% Ornithine 첨가), ONPG(배지 22)시험을 실시한다. 장염비브리오는 0% 및 10% NaCl을 가한 Peptone수에서 발육 음성, 3% 및 8% NaCl을 가한 Peptone수에서 발육 양성, VP 음성, 만니톨에서 산생성 양성, Ornithine 분해 양성, Arginine 분해 음성, ONPG 시험 음성, 3% NaCl을 가한 Nutrient Broth, 42℃에서 발육 양성이다.

16) 세균(세균발육시험)-통‧병조림제품, 레토르트제품 등

① 가온보존시험

검체 3관(또는 병)을 인큐베이터에서 35±1℃에서 10일간 보존한 후, 상온에서 1일간 추가로 방치하면서 관찰하여 용기‧포장이 팽창 또는 새는 것을 세균발육 양성으로 한다. 가온보존시험에서 음성인 것은 다음의 세균시험을 한다.

② 세균시험

㉮ 시험용액의 조제

검체 3관(또는 병)의 개봉부의 표면을 70% 알코올탈지면으로 잘 닦고 개봉하여 검체 25g을 인산완충희석액 225㎖에 가하여 균질화 시킨다. 균질화 된 검체액 1㎖를 시험관에 채취하고 인산완충희석액 9㎖에 가하여 잘 혼합하여 이것을 시험용액으로 한다.

㉯ 시험법

시험용액을 1㎖씩 5개의 티오글리콜린산염 배지(배지 13)에 접종하여 35℃에서 48±3시간 배양하고 어느 배지에서도 균의 증식이 확인된 것은 양성으로 한다.

17) 클로스트리디움 퍼프린젠스(Clostridium perfringens)

(1) 증균배양

1) 일반사항 (1) 검체의 채취 및 취급 ② 시험용액의 조제에 의해 만들어진 검액 1㎖를 Cooked Meat Medium(배지 33)의 배지 아래 부분에 접종하여 37℃에서 18～24시간 혐기 배양한다.

(2) 분리배양

카나마이신을 200㎍/㎖의 농도로 가한 난황 첨가 CW한천평판배지(배지 27)에 증균 배양액을 접종하여 35℃에서 18～24시간 혐기 배양한 결과 분리배지 상에서 직경 2㎜정도의 약간 돌기된 유황색으로 주변에 혼탁한 백색환이 있는 집락은 확인시험을 실시한다.

(3) 확인시험

분리배양된 평판배지상의 집락을 보통한천배지(배지 8)에 옮겨 37℃에서 18～24시간 혐기배양한 후 그람염색을 실시한다. 또 동시에 보통한천배지를 37℃에서 18～24시간 호기배양하여 균의 비발육을 확인한다. 그람양성간균으로 확인된 집락은 glucose, lactose, inositol, raffinose를 1% 가한 4종의 GAM 당분해용 반유동배지(배지 34)에 옮겨 37℃에서 3일간 배양후 BTB-MR지시약(시액 4)을 가해서 붉은 색으로 변하는 것을 양성으로 판정한다. 운동성은 GAM당분해용 반유동배지(배지 34)에서 37℃에서 1～2일간 배양하여 운동성의 유무를 관찰한다. Glucose, lactose, inositol과 raffinose를 분해하며 운동성이 없는 것을 확인하면 lecithinase 억제시험을 실시한다. 난황이 포함된 TSC한천배지(배지 41)에 접종하여 35℃에서 24시간 혐기배양한 후 2～4㎜의 불투명한 환을 가지는 황회색 집락을 양성으로 판정한다.

18) 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes)

(1) 증균배양

우유, 유제품, 가공식품 및 수산물의 검체에 대해서는 증균배지로 Listeria 증균배지(배지 35)를 사용하고, 식육 및 가금류의 검체는 1차 증균배지로 UVM-modified Listeria 증균배지(배지 36)를 사용한다.

검체 25g 또는 25㎖를 취하여 225㎖의 Listeria 증균배지 또는 UVM-modified Listeria 증균배지를 가한 후 30℃에서 24시간 배양한다. 식육 및 가금류 등의 검체는 배양액 0.1㎖를 취하여 Fraser Listeria 배지(배지 35) 10㎖에 접종하여 2차 증균을 실시한다.

(2) 분리배양

증균배양액을 멸균된 면봉을 이용하여 Oxford agar(배지 38) 또는 Lithium chloride- phenylethanol-moxalactam 한천배지(배지 39)에 접종하여 30℃에서 24～48시간 배양한다. 의심집락이 확인되면 이를 0.6% yeast extract가 포함된 Tryptic Soy 한천배지(배지 40)에 접종하여 30℃에서 24～48시간 배양한다.

(3) 확인시험

그람염색 후 그람양성 간균이 확인되면 hemolysis, motility, catalase, CAMP test와 mannitol, rhamnose, xylose의 당분해시험을 실시한다. 이 결과 β-hemolysis를 나타내고 catalase 양성, motility 양성을 나타내며 CAMP test결과 Staphylococcus aureus(ATCC 25923)에서 양성, Rhodococcus equi(ATCC 6939)에서 음성으로 나타나는 동시에 당분해시험 결과 mannitol 비분해, rhamnose 분해, xylose 비분해의 결과를 보일 경우 Listeria monocytogenes 양성으로 판정한다.

19) 대장균 O157:H7(Escherichia coli O157:H7)

(1) 증균배양

검체 25g 또는 25㎖를 취하여 225㎖의 mEC 배지(배지 42)에 가한 후 35℃에서 24시간 증균 배양한다.

(2) 분리배양

증균배양액을 MacConkey Sorbitol 한천배지(배지 43)에 접종하여 35℃에서 18시간 배양한다. Sorbitol을 분해하지 않는 무색집락을 취하여 EMB 한천배지(배지 6)에 접종하여 35℃에서 24시간 배양하고, 녹색의 금속성 광택이 확인된 집락은 확인시험을 실시한다.

(3) 확인시험

EMB 한천배지에서 녹색의 금속성 광택을 보이는 집락을 보통한천배지(배지 8)에 옮겨 35℃에서 24시간 배양 후 그람음성간균임을 확인하고 생화학시험을 실시한다.

(4) 혈청형 시험

대장균으로 확인동정 된 균은 O157 항혈청을 사용하여 혈청형을 결정하고, O157이 확인된 균은 H7의 혈청형 시험을 한다.

20) 여시니아 엔테로콜리티카(Yersinia enterocolitica)

(1) 증균배양

검체 25g 또는 25㎖를 취하여 225㎖의 PSBB 배지(배지 44)에 가한 후 10℃에서 10일간 배양한다.

(2) 분리배양

증균배양액 0.1㎖를 0.5% KOH가 함유된 0.5% 식염수 1㎖에 가하여 수초간 섞는다. 이 용액을 MacConkey 한천배지(배지 30)와 CIN 한천배지(배지 45)에 각각 접종하여 30℃에서 24시간 배양한다.

(3) 확인시험

MacConkey 한천배지에서 유당을 비분해하는 집락이나 CIN배지에서 중심부가 짙은 적색을 보이는 집락을 골라 각각 TSI 사면배지(배지 32)의 사면과 고층부에 접종하여, 35℃에서 24시간 배양 후 고층부와 사면이 노랗고 가스와 황화수소가 발생하지 않은 균주를 선택하여 25℃, 37℃에서 운동성 시험 및 urea, citrate시험 등을 한다. 이 때 여시니아 엔테로콜리티카는 37℃에서는 운동성을 나타내지 않고 25℃에서 운동성을 가지는 특성이 있다. 또한 urea시험 양성, citrate시험 음성이며 그람음성 간균일 때 양성으로 판정한다.

21) 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)

(1) 분리배양

검체 25g 또는 25㎖를 취하여 225㎖의 인산완충희석액에 가하여 균질화한 검액을 MYP한천배지(배지 46)에 접종하여 30℃에서 24시간 배양한다. 배양후 혼탁한 환을 갖는 분홍색 집락을 선별한다. 이 때 명확하지 않을 경우 24시간 더 배양하여 관찰한다.

(2) 확인시험

MYP 한천배지에서 전형적인 집락을 선별하여 보통 한천배지에 접종하고 30℃에서 24시간 배양한다. 배양후 그람염색을 실시하여 포자를 갖는 그람양성, 긴 형태의 간균으로 확인된 균은 운동성, nitrate환원능, VP, β-hemolysis, 혐기배양시 포도당 이용 등의 생화학시험을 실시한다.

22) 캠필로박터 제주니(Campylobacter jejuni)

(1) 증균배양

검체 25g 또는 25㎖를 취하여 항생제 혼합액1이 첨가된 HUNT배지(배지 47) 100㎖에 넣고 균질화한 후 35℃에서 4～5시간 동안 미호기적(5% O2, 10% CO2, 85% N2)으로 1차 증균한다. 1차 증균후 cefoperazone 용액(0.8g/100㎖) 0.4㎖를 첨가하고 42℃에서 24～48시간 미호기적으로 2차 증균한다. 단, 유제품의 경우에는 1차 증균시 항생제 혼합액 2를 사용하고, 2차 증균시에는 rifampicin용액(0.125g/100㎖) 0.4㎖를 첨가하여 배양한다.

(2) 분리배양

증균배양액을 modified Campy blood free 한천배지(배지 48) 또는 Abeyta-Hunt 한천배지(배지 49)에 각각 접종하여 42℃에서 24～48시간 미호기적으로 암소에서 배양한다.

(3) 확인시험

Modified Campy blood free 한천배지상에서 원형 또는 불규칙한 형태로서 반투명한 흰색 또는 투명한 집락, Abeyta-Hunt 한천배지(배지 49)상에서 무지개빛 광택 집락을 선별하여 항생제를 넣지 않은 Abeyta-Hunt 한천배지에 신속히 접종하여 배양한다. 배양된 집락을 취하여, 암시야 또는 위상차현미경으로 검경하거나 또는 대비 염색하여 지그재그 모양을 관찰한다. 이 때 대비염색은 10㎖ 식염수에 2방울의 crystal violet을 혼합한 용액을 이용한다. 현미경상으로 확인된 균에 대하여 catalase 및 oxidase 양성임을 확인한다. 확인된 균에 대하여, hippurate분해 양성, 황화수소 비생성, nalidixic acid 감수성, cephalothin 내성, 25℃에서 비생육, 42℃에서 생육하는 것 등 생화학시험을 실시한다.

23) 클로스트리디움 보툴리눔(Clostridium botulinum)

(1) 증균배양

고형 또는 반고형물 검체는 동량의 젤라틴 인산완충액(시액⑤)을 첨가하고 균질화하여 시험용액으로 하며, 액상 검체는 그대로 사용한다. 1～2g 또는 1～2㎖의 시료를 2개의 Cooked Meat배지(배지 33) 15㎖에 접종하여 35℃에서 18～24시간 배양하고, 2개의 TPGY배지(배지 50)에 같은 방법으로 접종하여 26℃에서 7일간 배양한다. 단, 접종전 각 배지는 10～15분간 중탕하여 탈산소한 후 빨리 냉각하여 사용하며, 시료는 배지 아래 부분에 천천히 접종하고 교반하지 않는다. 배양 7일후 검경하여 전형적인 클로스트리디움이 관찰되면 다음의 분리배양을 실시하고, 관찰되지 않는 경우에는 추가적으로 10일간 더 배양한다.

(2) 분리배양

증균배양액 1～2㎖와 동량의 여과 제균한 알코올을 잘 혼합하여 실온에서 1시간 방치한 후, Liver-Veal 난황 한천배지(배지 51) 또는 혐기성 난황 한천배지(배지 52)에 접종하여 35℃에서 48시간 혐기적으로 배양한다. 배양 후 융기되거나 평평하며, 표면이 매끈하거나 거친 집락으로, 약간 퍼져 있거나 불규칙한 것을 선택하여 약 10개를 취한다. 경우에 따라서는 집락 주위에 혼탁한 환이 생긴다.

○ 젤라틴-인산완충액

Gelatin	2g

Disodium Phosphate	4g

위의 성분을 증류수 1,000㎖에 녹여 pH 6.2로 조정하고 121℃에서 15분간 가열한다.

(3) 확인시험

분리 균에 대하여 Gram 양성의 간균과 균체 말단에 아포가 형성되는 것을 관찰하고, 호기조건으로 37℃에서 2～3일간 배양하였을 경우 균이 발육되지 않는 것을 확인한다.  0.1%의 glucose를 첨가한 GAM배지에 접종하여 37℃로 1～4일간 배양하여 운동성이 있는 것을 양성으로 판정하며, 질산염환원능이 없으므로 glucose 0.1%, KNO3 0.3%를 가한 GAM 당분해용 반유동배지(배지 34)에 접종하여 37℃에서 2일간 배양한 후 지시약(시액 6)을 가하였을 경우 색의 변화가 없어야 한다.  우유를 pH 6.8되도록 조정하여, FeSO4 0.05～0.1g을 첨가한 배지에 균을 접종하여 37℃로 배양한 후 우유를 분해하는 것을 양성으로 판정(각 독소 type에 따라 분해능이 다름)한다.

(4) 독소확인시험

○ 시험 :

시험용액을 4℃, 10,000g에서 20분간 원심분리하여 그 상층액을 pH6.0으로 조정한 후, 동량의 2% trypsin용액을 가하여 37℃에서 30～60분간 반응시킨 후, 이 용액 1㎖당 100U의 penicillin과 100㎍의 chloramphenicol을 첨가한다. 중량 15～20g의 ICR계 마우스 5군(1군당 2～3수)을 준비하여 위의 시료액을 다음과 같은 5가지 방법으로 복강내 주사한다.

① 시험용액 0.5㎖를 그대로 주사한다.

② 시험용액을 100℃로 10분간 가열한 후 0.5㎖씩 주사한다.

③ 시험용액에 A형 항독소혈청(1～2unit/㎖)을 시험관 내에서 동량으로 혼합한 후 37℃에서 15분간 반응시킨 후 0.5㎖씩 주사한다.

④ ③과 같은 방법으로 B형 항독소혈청을 혼합하여 반응시킨 후, 0.5㎖씩 주사한다.

⑤ ③과 같은 방법으로 E형 항독소혈청을 혼합하여 반응시킨 후, 0.5㎖씩 주사한다

○ 판 정 :

①～⑤군의 마우스를 1주간 관찰한 후 다음에 의해서 판정한다.

1) ①군의 마우스가 사망하지 않았다면 음성으로 판정한다.

2) ①군 마우스가 특정한 중독증상(복벽함몰, 사지마비, 호흡곤란)을 보이면서 사망하고 ②군은 생존하였을 경우,

i) ③～⑤군 중 한군이 생존하였다면 생존군에 사용한 항혈청유형의 독소를 양성으로 판정한다.

ii) ③～⑤군 모두 또는 각 군의 일부가 사망하였다면 시험용액을 희석하여 재시험하고 기타유형(C1, C2, D, F, G형)의 항독소혈청을 사용하여 중화시험을 실시한다.

8. 인삼제품 중 농약잔류시험법

삭제<2006.   .   >

9. 붕해시험법

붕해시험법은 내용고형제품의 시험액에 대한 붕해성 또는 저항성을 시험하는 방법이다. 따로 규정이 없는 한 정제품, 적당한 제피제로 제피를 한 정제식품, 환식품, 캅셀식품, 과립식품, 장용성의 제품(식품)은 각각 다음의 시험에 적합하여야 한다.

1) 장치

이 시험에 쓰는 장치는 시험기, 안지름 약 110㎜이고 높이 약 155㎜인 비커, 적당한 가열기 및 전동기로 되어 있으며, 따로 조작법에 따라 보조판 또는 보조통을 쓴다.

그림 9-3

A : 플라스틱판

B : 체눈의 간격 2.0㎜,

선재의 지름 6.0㎜의 내산성 망

C : 내산성 금속판

D : 유리관

E : 나사

F : 지주 및 나사

G : 매다는 축

H : 온도계 삽입구

J 및 M : 플라스틱통

K : 체눈의 간격 0.42㎜,

선재의 지름 0.29㎜의 내산성 망

L : 내산성 철사 손잡이

(1) 시험기

시험기는 그림 9-1과 같이 지름 90㎜, 두께 6㎜의 상하 2장의 플라스틱판 A가 있고 여기에 각각 지름 24㎜의 구멍이 같은 간격으로 6개 뚫어져 있다. 아래의 플라스틱판의 아랫면에는 체눈의 간격 2.0㎜, 선재(線材)의 지름 0.6㎜의 내산성 망 B를 달고 위의 플라스틱판의 윗면과 아래의 플라스틱판 망의 아랫면에는 각각의 구멍에 해당하는 부분에 지름 22～23㎜의 구멍을 6개 뚫은 지름 90㎜, 두께 1㎜의 내산성 금속판 C를 단다. 상하의 플라스틱판의 구멍에 안지름 21.5±0.5㎜, 바깥지름 23.5㎜, 길이 77.5±2.5㎜의 유리관 D 6개를 끼우고 지주(支柱) 3개를 써서 내산성 금속판 위에 나사로 유리관을 고정한다. 중심에 매단 축(軸) G는 길이 80㎜로 하고 그 위 끝은 전동기를 써서 부드럽게 상하운동을 할 수 있도록 한 수축(受軸)에 단다. 다만, 시험기는 유리관 및 망에 관한 규정을 제외하고는 그 구조를 다소 변경할 수도 있다.

(2) 보조판

보조판은 그림 9-2에 표시한 것과 같이 높이 9.50±0.15㎜, 지름 20.70±0.15㎜의 투명하고 매끄러운 플라스틱제의 원주로 비중은 1.18～1.20이다. 이 윗면에서 아랫면까지에 지름 2㎜의 구멍이 5개가 뚫어져 있으며 그 1개는 중심을 통하고 다른 4개는 중심에서 6㎜의 거리에 같은 간격으로 위치하고 있다. 보조판의 측면에는 V자형으로 자른 것이 4개 같은 간격으로 있고 각각 자른 부분의 폭은 윗면이 9.5㎜, 아랫면이 1.6㎜, 깊이는 윗면 2.55㎜, 아랫면 1.6㎜이다.

(3) 보조통

보조통은 그림 9-3에 표시한 것과 같이 안지름 12㎜, 바깥지름 17㎜, 길이 20㎜의 플라스틱통 M의 양단 바깥쪽의 나사를 풀고 안지름 12㎜, 바깥지름 17㎜, 길이 2.5㎜의 플라스틱통 J의 안쪽나사를 풀고 체눈 간격 0.42㎜, 선재의 지름 0.29㎜의 내산성의 망을 놓고 먼저의 원통의 양단에 밀착시킨 것이다. 보조통의 상하 망의 간격은 20±1㎜로 하고 바깥쪽 중앙부에 지름 1㎜의 내산성 철사를 써서 높이 80㎜의 손잡이를 단다.

2) 시험액

(1) 제 1 액 : 염화나트륨 2.0g에 염산 7.0㎖ 및 물을 넣어 녹여 1ℓ로 한다. 이 액은 무색투명하고 그 pH는 약 1.2이다.

(2) 제 2 액 : 0.2mol/ℓ 인산이수소칼륨시액 250㎖에 0.2 mol/ℓ 수산화나트륨시액 118㎖ 및 물을 넣어 1ℓ로 한다. 이 액은 무색투명하고 그 pH는 약 6.8이다.

(3) 물

3) 조작법

시험기를 수축에 달고 비커 속에 넣어 1분간 29～32회 왕복, 진폭 53～57㎜로 부드럽게 상하운동을 하도록 조절한다. 시험기가 최하로 내려갔을 때 아래의 망 면이 비커의 바닥으로부터 25㎜가 되도록 하고 비커에 넣는 시험액의 양은 시험기가 최하로 내려갔을 때 시험기의 윗면이 액의 표면에 일치하도록 한다. 시험하는 동안의 액의 온도는 37±2℃로 유지한다.

과립제품 이외는 검체 6개를 취하여 시험기의 유리관에 1개씩 넣고 시험기를 미리 온도 및 액량을 조절한 비커중의 시험액에 담그고, 일정시간 상하운동을 한 다음 시험기를 가만히 시험액에서 꺼내고 유리관내의 검체상태를 관찰한다. 보조판을 쓰도록 지정되어 있을 경우에는 시험기의 유리관에 검체를 넣고 다음에 보조판 윗면을 위로 하여 1개씩 가만히 넣은 다음 앞에서와 같은 조작을 한다. 다만, 판정이 곤란할 때에는 보조판을 쓰지 않을 수 있다.

(1) 정제식품

물을 시험액으로 하고 보조판을 넣어 30분간 상하운동을 시킨 다음 관찰할 때 검체의 잔류물이 유리관내에 없거나 있더라도 해면상(海綿狀)의 물질이든가 또는 연질의 물질 또는 니상(泥狀)의 물질이 약간 있을 때에는 적합한 것으로 한다.

검체 6개중 검체가 원형상태로 머무르는 것이 1개 또는 파편상태로 있는 것이 1개가 있을 때에는 새로 검체 6개를 가지고 위의 시험을 되풀이하여 검체의 잔류물이 유리관내에 없거나 있더라도 해면상의 물질이든가 또는 연질의 물질 또는 니상(泥狀)의 물질이 약간 있을 때에는 적합한 것으로 한다.

(2) 적당한 제피제로 제피를 한 정제식품

물을 시험액으로 하고 보조판을 넣어 60분간 상하운동을 시킨 다음 관찰할 때 검체의 잔류물이 유리관내에 없든가 있더라도 피막이든가 또는 연질의 물질 또는 해면상의 물질 또는 니상(泥狀)의 물질이 약간 있을 때에는 적합한 것으로 한다.

검체 6개중 원형상태로 머무르는 것이 1개 또는 피막이 용해, 개구(開口) 또는 박리(剝離)되었더라도 내용물의 방출이 인정되지 않는 것 1개가 남았을 때에는 검체 6개를 다시 취하여 이 시험을 반복하여 검체의 잔류물이 유리관내에 없든가 있더라도 피막이든가 또는 연질의 물질 또는 해면상의 물질 또는 니상의 물질이 약간 있을 때에는 적합한 것으로 한다.

(3) 환식품

정제식품의 시험법에 따른다. 다만, 시험은 제 1액에서 60분간 하고 검체의 잔류물이 유리관내에 남아 있을 때에는 계속하여 제 2액에서 60분간 시험한다.

(4) 캅셀식품

물을 시험액으로 쓰고 보조판을 넣어 20분간 상하운동을 시킨 다음 관찰할 때 검체의 잔류물이 유리관내에 없거나 있더라도 피막이든가 또는 연질의 물질 또는 니상(泥狀)의 물질이 약간 있을 때에는 적합한 것으로 한다.

검체 6개중 원형상태로 머무르는 것이 1개 또는 피막이 용해, 개구 또는 박리되었더라도 내용물의 방출이 되지 않은 것이 1개 남았을 때에는 새로 검체 6개를 가지고 이 시험을 되풀이하여 검체의 잔류물이 유리관에 없든가 있더라도 피막이거나 또는 연질의 물질 또는 니상(泥狀)의 물질이 약간 있을 때에는 적합한 것으로 한다.

(5) 과립식품

과립제품을 35호(500㎛) 체로 쳐서 35호 체위에 잔류한 검체 0.10g씩을 각각 보조통 6 개에 넣고 보조통을 시험기 유리관속에 각각 1개씩 넣어 아래쪽에 고정시키고 따로 규정이 없는 한 시험액으로 물을 써서 30분간 상하운동을 시킨 다음, 보조통을 꺼내어 관찰할 때 검체의 잔류물이 보조통내에 없든가 있더라도 원형상태로 머무르는 것이 보조통 1 개에만 있을 때 또는 피막이거나 또는 연질의 물질 또는 니상(泥狀)의 물질이 약간 있을 때에는 적합한 것으로 한다. 다만, 제피를 한 과립에 대하여는 시험액으로 물을 써서 60분간 상하운동을 시킨다.

(6) 장용성식품

① 과립식품 또는 과립상의 형으로 충전한 캅셀식품

다음의 ㉮ 제 1액에 의한 시험 및 ㉯ 제 2액에 의한 시험의 두 시험을 한다.

㉮ 제 1액에 의한 시험

과립제품 또는 캅셀식품 속에서 빼낸 내용물을 35호(500㎛) 체로 쳐서 35호 체위의 잔류물 0.10g씩을 각각 보조통 6개에 넣고 보조통을 시험기의 유리관에 1개씩 넣어 밑에 고정하고 제 1액을 시험액으로 하여 60분간 상하운동을 시킨 다음 관찰할 때 시험기의 망목으로부터 떨어지는 입자가 15알갱이 이내일 때에는 적합한 것으로 한다.

㉯ 제 2액에 의한 시험

따로 제 1액에 의한 시험과 동일한 방법에 따라 검체 0.10g씩을 각각 보조통 6개에 넣고 보조통을 시험기의 유리관에 1개씩 넣어 아래에 고정하고 제 2액을 시험액으로 하여 30분간 상하운동을 한 다음 관찰할 때 검체의 잔류물이 보조통내에 없거나 있더라도 원형대로 있는 것이 보조통 1개에만 있을 때 또는 있더라도 피막이거나 또는 연질의 물질 또는 니상의 물질이 약간 있을 때에는 적합한 것으로 한다.

② 과립식품 또는 과립상의 형으로 충전한 캅셀제 이외의 장용성 제제

다음의 ㉮ 제 1액에 의한 시험 및 ㉯ 제 2액에 의한 시험의 두 시험을 한다.

㉮ 제 1액에 의한 시험

시험액으로 제 1액을 써서 120분간 상하운동을 한 다음 관찰할 때 검체 6개중 붕해, 장용성피막의 개구, 박리 또는 파손 등으로 내용물이 방출되는 것이 1개 이하일 때에는 제 1액에 의한 시험에 적합한 것으로 하고 2개일 때에는 새로 검체 6개를 가지고 이 시험을 되풀이한다. 이 때 6개 모두가 앞에서 말한 이상이 없을 때에는 적합한 것으로 한다.

㉯ 제 2액에 의한 시험

따로 검체 6개를 취하여 제 2액을 시험액으로 하고 보조판을 넣어 60분간 상하운동을 시킨 다음 관찰할 때 검체의 잔류물이 유리관내에 없든가 있더라도 피막이거나 해면상의 물질이든가 또는 연질의 물질 또는 니상의 물질이 약간 있을 때에는 적합한 것으로 한다.

10. 미량성분시험법

1) 무기성분

(1) 시험용액의 조제

<건식분해>

검체를 <표10-1>과 같이 회화용기에 취하여 탄화시킨 후 550～600℃의 온도에서 여러 시간 가열하여 백색～회백색의 회분이 얻어질 때까지 회화한다. 이 회분을 방냉 후 주의하여 물로 적신 후 염산용액(1→2) 약 10㎖를 가해 수욕상에서 완전 증발 건고시킨다. 이 건고물에 염산용액(1→4) 약 8～10㎖를 가해 수분 가열 후 100㎖ 메스플라스크에 여과한다. 불용물은 여지와 같이 사용했던 회화용기에 옮겨 건고한 후 다시 회화한다. 이 회분을 물로 적시어 염산용액(1→4) 약 2㎖를 가해 물 약 5㎖로 희석한 후 수욕상에서 가온하고, 여과한 액을 앞의 100㎖ 메스플라스크에 채워 물을 가하여 100㎖로 하여 시험용액으로 한다.

<습식분해>

검체를 <표10-1>과 같이 200～300㎖ 분해 플라스크에 취하여 질산 5㎖를 가하여 서서히 약하게 가열하고 최초의 심한 반응이 끝난 후 다시 온도를 올려 가열시킨다. 질산이 휘산되어 내용물이 거의 건고될 때까지 가열하고 질산용액(1→2) 10㎖와 70% 과염소산 10㎖를 가하여 가열을 조절하면서 서서히 가열시킨다. 고형물이 완전히 용해되고 액이 거의 무색이 될 때까지 가열을 계속하여 분해한다. 만약, 액이 착색되어 있으면, 70% 과염소산 수㎖를 가하여 가열한다. 분해 후 냉각하고 소량의 물로 희석한 후 직경이 9㎝의 자제증발접시에 액을 씻어 옮기고 증발 건고하여 과염소산을 증발시킨다. 잔류물에 염산용액(1→2) 약 10㎖를 가하고 동량의 물로 희석시켜 수욕상에서 가온하여 완전히 녹인 후 100㎖ 메스플라스크에 옮겨 물을 가하여 전량을 100㎖로 하여 시험용액으로 한다.

<표 10-1> 검체채취량

무기성분 종 류	칼슘	채취량	인	채취량	철	채취량
쌀(米)류 잡곡류 감자 곤약류 과자 당류 유지류 두류	2～15mga) 4～53 5～97 2～200 1～58 1～10 15～300	20～50g 5～30 5～30 1～50 5～50 20～50 1～20	5～300mga) 25～360 5～74 0～200 1～14 0～20 43～710	1～10g 1～5 2～10 1～20 5～20 5～20 1～2	0.1～3.5mga) 0.3～5.0 0.3～2.5 0.3～4.0 0.1～2.3 0.1～0.4 1.1～11.0	함유량이 10mg이하 의 것은 10g이상

무기성분 종 류	칼슘	채취량	인	채취량	철	채취량
종실류 수조육류 난류 유류 채소류 과실류 버섯류 해초류 조미류	3～282 2～ 58 10～150 50～150 3～440 2～ 83 0～ 16 115～1,700 5～553	1～40 5～50 2～20 2～ 5 1～40 5～50 20～50 1～ 2 1～30	15～970 21～400 11～570 25～980 5～240 4～130 15～240 8～600 10～340	1～ 5 1～ 5 1～ 5 1～ 5 1～10 1～10 1～ 5 1～ 5 1～ 5	1.0～16.0 0.9～16.0 0.1～ 6.3 0.1～ 1.0 0.1～10.0 0.1～ 4.0 0.5～ 3.9 4.0～140.0 1.1～45.0
a) 검체 100g중에 함유한 mg 수임

(2) 칼슘

① 과망간산칼륨 용량법

㉮ 시약

Ⓐ 수산암모늄용액：수산암모늄[(NH4)2C2O4] 3.0g을 물을 가하여 100㎖로 한다.

Ⓑ 메틸레드지시약：0.1% 메틸레드알코올용액

Ⓒ 요소：특급요소 70～80℃의 저온으로 건조한 다음 흡습하지 않도록 보존한다.

Ⓓ 세척용암모니아수(1→50)

Ⓔ 황산용액(1→25)

Ⓕ 0.02N 과망간산칼륨용액

② 시험조작

무기성분 시험용액 조제에서 얻은 시험용액 중에 40㎖(Ca 1～12㎎에 대응하는 양)를 200㎖의 비커에 취하여 메틸레드시액 수방울 및 수산암모늄용액 10㎖를 가한 다음 요소 2～5g을 가해 녹인다. 비커를 시계접시로 덮고 약하게 가열을 계속시킨다. 메틸레드시액을 색이 적색에서 등황색으로 (pH 약 5.6) 되었을 때 가열을 중지하고 방냉한다. 이를 2시간 이상(침전이 적을 때는 하룻밤) 실온으로 방치한다. 이 때의 액량은 약 20～30㎖정도이다. 충분히 침전을 형성시킨 후 석출 전 수산칼슘 결정을 유리여과기(15AG-4)로 흡입여과하고 세척용 암모니아수 30～40㎖를 수회 나누어 침전과 여지를 잘 씻는다. 세척이 끝나면 침전 생성에 사용한 비커를 앞의 유리여과기의 밑에 놓고 여과에 사용한 유리봉을 유리여과기에 넣어 미리 70℃이상으로 가온한 황산용액(1→25)을 유리여과기에 주입한다. 유리봉으로 교반하여 잠시 방치하고 수산칼슘을 용해한 다음 흡입한다. 다음 흡입을 그치고 가온한 황산용액(1→25) 약 5～7㎖를 유리여과기에 주입하고 유리봉으로 교반하여 내벽을 씻고 흡입한다. 이 조작을 2회 반복한다. 비커를 여과장치에서 들어내고 65～80℃로 가열하여 0.02N 과망간산칼륨용액으로 적정한다. 공시험에 대하여도 같은 조작을 한다.

[계  산]

[eqn: rm칼슘(mg/100g)={(b-a)×0.4008×F×V×100}over{S}]

a：공시험에 대한 0.02N 과망간산칼륨용액의 소비㎖ 수

b：검액에 대한 0.02N 과망간산칼륨용액의 소비㎖ 수

F：0.02N 과망간산칼륨용액의 역가

V：시험용액의 희석배수

S：검체의 채취량(g)

③ 원자흡광광도법

1) 무기성분 (1) 시험용액의 조제에 따라 처리한 검체를 물 대신 1N 염산용액을 사용하여 칼슘 농도 1～5㎍/㎖가 되도록 조정하여 5. 유해성금속시험법 2) 측정 (1) 원자흡광광도법에 따라 측정한다. 이 때 사용될 1N 염산용액에는 La으로서 1,000ppm이 되도록 염화란탄(LaCl3)을 첨가하거나 또는 Sr으로서 5,000ppm이 되도록 염화스트론티움(SrCl2)을 첨가하여 사용한다.

(3) 인몰리브덴청 비색법)

① 시약

㉮ 몰리브덴산암모늄용액

몰리브덴산암모늄(NH4)6Mo7O24‧H2O 25g을 물 300㎖에 녹인다. 따로 황산 75㎖를 물 200㎖로 희석하여 이것을 상기 용액에 가하고 여과한다.

㉯ 하이드로퀴논용액

하이드로퀴논(C6H6O2) 0.5g을 물을 가하여 100㎖로 한다. 여기에 황산 한 방울을 가하여 냉소에 저장한다. 만일 착색되면 다시 만들어 사용한다.

㉰ 아황산나트륨용액

약 10% 용액‧무수아황산나트륨 10g을 물을 가하여 100㎖로 하여 여과한다.

사용할 때 새로 만든다.

㉱ 표준인용액

미리 데시케이터 중에서 건조해 놓은 산성인산칼륨(KH2PO4) 0.4394g을 물을 가하여 1ℓ로 한다. 이 액 50㎖를 취하여 다시 물을 가하여 200㎖로 한다. 이 액 1㎖는 0.025㎎의 인을 함유한다.

② 시험조작

무기성분 시험용액의 조제에서 얻은 시험용액 중의 1㎖를 25㎖ 메스플라스크에 정확히 취하고 따로 표준인용액 2㎖를 25㎖ 메스플라스크에 취한다.

양쪽 플라스크에 몰리브덴산암모늄용액 2㎖씩을 가하여 혼합하여 수분간 방치한다.

다음 양쪽에 하이드로퀴논용액 2㎖씩을 가하여 혼합한 후 아황산나트륨용액 2㎖를 가해 이때에 시간을 기록한다.

양쪽 다 물을 가하여 25㎖로 하여 진탕 혼합한다.

정확하게 30분 방치한 후 즉시 분광광도계를 사용하여 파장 650㎚에서 흡광도를 측정한다.

공시험에 대하여도 같은 조작을 한다.

[계  산]

[eqn: rm인(mg/100g)=0.05×{A}over{As}×{1}over{S}×V×100]

As：표준용액의 흡광도

A ：검액의 흡광도

S ：검체의 채취량(g)

V ：시험용액의 희석배수

(4) 철

① 올쏘 페난트로린 비색법

㉮ 시약

Ⓐ 페난트로린용액：올쏘 페난트로린 염산염(C12H8N2‧HCl‧H2O) 0.5g을 물을 가하여 200㎖로 하여 냉소에 보존한다.

Ⓑ 하이드로퀴논용액：하이드로퀴논(C2H6O2)을 물에 녹여 쓰며 사용할 때마다 새로 만들어야 한다(희석배수 1%).

Ⓒ 구연산나트륨용액：특급 구연산나트륨(Na3C6H5O7‧H2O) 50g을 물을 가하여 200㎖로 한다. 필요하면 여과하여 냉소에 보존한다.

Ⓓ 브롬페놀블루시액：브롬페놀블루 0.1g을 0.05N 수산화나트륨액 3㎖l로 녹이고 물을 가하여 250㎖l로 한다.

Ⓔ 철표준액：특급 황산제1철 암모늄[Fe(NH4)2(SO4)2‧6H2O] 0.7021g을 약 1%의 염산에 용해하여 1ℓ로 한다.

이 액 1ℓ중에는 철 0.1㎎을 함유한다.

㉯ 시험조작

시험용액의 조제에서 얻은 시험용액중의 10㎖를 피펫으로 25㎖의 메스플라스크에 취하고 같은 10㎖를 시험관(혹은 작은 삼각플라스크)에 취한다.

후자는 pH조절용 대조액으로 쓴다. 시험관쪽에는 브롬페놀블루시액 4방울을 가하고 25㎖ 메스플라스크 쪽에는 하이드로퀴논용액 1㎖와 또 페난트로린용액 2㎖를 피펫으로 가한다. 구연산나트륨용액을 뷰렛 또는 5㎖ 메스피펫으로 취하여 시험관의 액중에 적가하고 액의 pH가 3.5가 되면 지시액을 가한 액의 색이 황색에서 황록색으로 변하는 점에서 적가를 그치고 이때까지 소요된 구연산나트륨용액의 ㎖수를 기록한다.

이와 같은 용량의 구연산나트륨용액을 메스플라스크쪽에 가하여 물로 25㎖의 표선까지 희석하여 20℃이상의 온도에서 1시간이상 방치한다. 하룻밤 방치해도 무방하다.

일단, 완전히 발색된 액은 적어도 48시간은 퇴색하지 않는다. 이를 분광광도계(Spectrophotometer)에서는 510㎚의 파장에서, 광전비색계에서는 녹색필터를 이용해서 발색액의 흡광도를 측정하여 비흡광계수를 구한다. 이것을 미리 작성하여 놓은 검량선과 대조하여 철의 양을 구한다.

검량선은 다음과 같이 하여 만든다. 즉, 철표준액을 물로 정확히 10배로 희석한다. 1, 2, 5, 10, 15 및 20㎖를 각각 1조씩 25㎖의 메스플라스크와 시험관 또는 작은 삼각플라스크에 취한다. 10㎖ 안되는 것은 물을 추가하여 거의 10㎖로 만든다. 상기 발색조작과 동일하게 pH 3.5에서 각 메스플라스크에서 발색시켜 흡광도를 측정하며, 농도 흡광곡선을 작성하고 검체중의 철 함량은 다음 식에 따라 산출한다.

[eqn: rm철(mg/100g)={A}over{S}×V×100]           [계산식]

A：흡광곡선에서 구한 철의 양(㎎)

S ：검체채취량(g)

V ：시험용액의 희석배수

② 원자흡광광도법

1) 무기성분 (1) 시험용액의 조제에 따라 처리한 검체를 물 대신 1N 염산용액을 사용하여 철 농도 1～4㎍/㎖가 되도록 조정하여 5. 유해성금속시험법 2) 측정 (1) 원자흡광광도법 ① 직접법에 따라 측정한다.

(5) 식염

① 회화법

식염 약 1g을 함유하는 양의 검체를 취하여 필요한 경우 수욕상에서 증발건고한 후 회화시켜 이를 물에 녹이고 다시 물을 가하여 500㎖로 한 후 여과하고 여액 10㎖에 크롬산칼륨시액 2～3방울을 가하고 0.02N 질산은액으로 적정한다.

[eqn: rm식염={b}over{a}×f×5.85(w/w%, w/v%)]        [계산식]

a：검체 채취량(g, ㎖)

b：적정에 소비된 0.02N 질산은액의 양(㎖)

f：0.02N 질산은액의 역가

② 직접법

①에 따라 취하여 물로 희석하여 500㎖로 한 후 그 10㎖를 취하여 ㉮ 회화법에 따라 적정한다.

(6) 나트륨

1) 무기성분 (1) 시험용액의 조제<건식분해법>에 따라 얻어진 시험용액을 나트륨농도 1～10㎍/㎖되게 조정하여 5. 유해성금속시험법 2) 측정 (1) 원자흡광광도법에 따라 시험한다.

(7) 칼륨

1) 무기성분 (1) 시험용액의 조제 <건식분해법 또는 5. 유해성금속시험법 1) 시험용액의 조제 (1) 황산-질산법>에 따라 얻어진 시험용액을 칼륨농도 1~10㎍/㎖ 되게 조정하여 5. 유해성금속시험법 2) 측정 (1) 원자흡광광도법에 따라 시험한다.

(8) 아연

1) 무기성분 (1) 시험용액의 조제 <건식분해법 또는 5. 유해성금속시험법 1) 시험용액의 조제 (1) 황산-질산법>에 따라 처리한 검체를 0.5N 질산용액으로 아연농도 1~10㎍/㎖ 되게 조정하여 5. 유해성금속시험법 2) 측정 (1) 원자흡광광도법에 따라 시험한다.

(9) 요오드

① 이온-선택 전극법

㉮ 시약

Ⓐ 3%(v/v) 초산 용액：빙초산 15㎖를 물로 희석하여 500㎖가 되게 한다.

Ⓑ 전극 보관 용액：요오드 표준원액을 물로 희석하여 0.1㎖/ℓ가 되게 한다. 요오드 전극을 이 용액에 담가서 보관하며 매주 새 용액으로 교환한다. 차광보관하며, 3개월간 보존가능하다.

Ⓒ 이온강도 조절액(5M 질산나트륨용액, ISA：ionic strength adjuster) 질산나트륨 42.5g을 물에 녹여 100㎖로 한다.

Ⓓ 2M 질산니켈용액：질산니켈‧6 수화물 58.2g을 물에 녹여 100㎖가 되게 한다.

㉯ 요오드 표준용액

Ⓐ 요오드 표준품(요오드 12.69g/ℓ, 0.1M)：요오드화나트륨 또는 요오드화칼륨 표준품을 사용한다. 실온에서 차광 보관하며, 개봉 후 6개월간 보존 가능하다.

Ⓑ 요오드 표준원액：요오드 표준품 8㎖를 물로 희석하여 1ℓ가 되게 한다(101.5㎍/㎖). 차광하여 보존하며 2주간 사용 가능하다.

Ⓒ 요오드 표준용액 Ⅰ：요오드 표준원액 5.0㎖를 물로 희석하여 500㎖가 되게 한다(1㎍/㎖). 차광하여 보존하며 2주간 사용 가능하다.

Ⓓ 요오드 표준용액 Ⅱ： 요오드 표준용액 I를 물로 10배 희석한다. 차광하여 보존하며 2주간 사용 가능하다(0.1㎍/㎖).

Ⓔ 기지의 첨가 표준용액：요오드 표준원액 Ⓑ 10.0㎖를 물로 희석하여 1ℓ가 되게 한다. 이 액 100㎖에 이온강도조절액(ISA), 2M 질산니켈 용액, 물을 각각 1.0㎖씩 첨가한 후 잘 혼합한다. 사용시 조제한다.

㉰ 기구

Ⓐ 전극：요오드 전극, 기준 전극(Ag/AgCl전극)

Ⓑ pH 측정기

Ⓒ 마그네틱바

Ⓓ 여과지(Whatman. 541)

㉱ 시험용액 조제

검체 100㎖(분말의 경우 10% 수용액)를 250㎖ 메스플라스크에 넣고 3% 초산용액 10㎖를 가한 후 물로 정용한다. 이 액을 여과하고 처음 10㎖는 버린다.

㉲ 시험조작

Ⓐ 전극 기울기 체크： 전극을 요오드 표준용액 Ⅱ 100㎖에 담그고 ISA, 2M 질산니켈 용액, 물을 각각 1.0㎖씩 가하고 약 2～5분 후 reading 전위계가 안정되었을 때 E1값을 측정한다.

전극을 물로 씻고 건조시킨 후 요오드 표준용액 Ⅰ 100㎖에 담그고 ISA, 2M 질산니켈 용액, 물을 각각 1.0㎖씩을 가하고, 약 2～5분 후 reading 전위계가 안정되었을 때 E2 값을 측정한다. 전극을 물로 씻고 건조시킨다. 전극의 기울기(S)는 E2-E1로 계산된다. 매 4시간마다 기울기를 측정하며, 직전에 측정한 기울기를 사용하여 요오드 함량을 계산한다.

Ⓑ 측정： 시험용액 100.0㎖를 비커에 넣고 마그네틱바로 저어주면서 ISA, 2M 질산니켈 용액, 진한 질산을 각각 1.0㎖씩 가하고 전극을 담근 후 약 2분 후 reading 전위계가 안정되었을 때 E3 값을 측정한다. 이 액에 즉시 기지의 첨가 표준용액 10.0㎖를 가하고 약 2～5분 후 reading 전위계가 안정되었을 때, E4 값을 측정한다.

[계  산]

검체 중의 요오드 함량(C) 계산은 다음과 같다.

C(㎍/100g) ＝ Q×0.9854×V×100

Q ＝ 0.0885/{antilog[(E4-E3)/S]-0.912}

0.9854：기지의 첨가 표준용액의 요오드 농도(㎍/㎖)

V：희석 배수

0.0885：표준용액 첨가 ㎖수/(표준용액 첨가 전 총 ㎖수＋표준용액 첨가 ㎖수)＝10/(103+10)

0.912：표준용액 첨가 전 총 ㎖수/(표준용액 첨가 전 총 ㎖수＋표준용액 첨가 ㎖수)＝103/(103＋10)

S：E2-E1

2) 비타민류

(1) 비타민A

① 삼염화안티몬에 의한 비색정량법

㉮ 시약

Ⓐ 에테르： 필요하면 증류한다. 초류액 및 마지막 유액 각 10%를 버린다.

Ⓑ 벤젠： 필요하면 증류한다.

Ⓒ 무알데히드에탄올： 에탄올 1l에 50% 수산화칼륨용액 5㎖ 및 아연분말 5g을 가해 약 2시간 환류냉각기를 달아 가온한 후 증류한다.

단, 초류액 및 마지막 유액 각 10%를 버린다.

Ⓓ 무수황산나트륨：무수황산나트륨을 2시간이상 120℃에서 가열한 것을 실리카겔 데시케이터중에 방냉한다(밀봉해서 보존한다).

Ⓔ 초산：빙초산 1l에 대해서 산화크롬 10g을 가해 2회 증류한다. 116℃이상의 증류액을 취한다.

Ⓕ 클로로포름：클로로포름 1l를 황산 20～30㎖씩으로 황산층이 착색되지 않을 때까지 수회 씻는다.

수세하여 황산을 제거하고， 15～20% 수산화나트륨용액 20～30㎖로 2～3회 씻은 후 수세한다.

여기에 탄산칼륨을 가하여 혼합한 후 냉암소에 약 12시간 이상 방치하고 탈수시켜 증류한다. 정제한 클로로포름은 갈색병에 넣어 냉동에 보존한다. 보존 중 흡습하지 않도록 주의한다. 이 클로로포름은 적어도 1주간은 사용이 가능하다.

Ⓖ 정색용액：삼염화안티몬 20g을 상기의 클로로포름 100㎖에 녹여 하룻밤 방치한 후 무수초산 2㎖를 가해 콜크마개나 폴리에틸렌마개를 하여 차광하여 상온으로 보존한다.

이 용액은 흡습성이 강하고 변질이 쉬우므로 조제 후 1주간 내에 사용한다.

Ⓗ 표준비타민A：비타민A유[1g중 비타민A 10,000국제단위(IU) 함유]를 사용한다.

Ⓘ 불활성가스：질소, 이산화탄소를 사용한다.

㉯ 시험용액의 조제

Ⓐ 비누화： 검체 채취량은 일반적으로 100～150단위에 상당하는 양을 비누화 플라스크에 취하고 피로갈롤 100㎎, 하이드로퀴논 100㎎을 가한다. 다음에 적어도 3㎖ 또는 동량의 50% 수산화칼륨용액 및 그 8배량의 무알데히드에탄올을 가해 환류냉각기를 달아 비등 수욕상에서 때때로 플라스크를 흔들어 주면서 30분간 비누화한다.

Ⓑ 추출： 비누화 후 흐르는 물에 식혀 냉각시키고 실온으로 한 다음 정확히 벤젠 100㎖를 가한다. 유리마개를 하고 15초간 격렬하게 흔든다. 침전이 있으면 그것이 침전될 때까지 방치한다. 다음에 250～300㎖의 분액깔때기에 옮기고 비누화플라스크에 침전물을 남기고 침전물을 씻어 옮길 필요는 없다. 분액깔때기에 1N 수산화칼륨액 100㎖를 가하여 15초간 격렬히 흔든 후 방치하여 분리시킨다. 혼탁된 물층은 버리고 벤젠층에 0.5N 수산화칼륨액 40㎖를 가해 진탕 혼합하고 다음에 벤젠층을 적어도 4회 물 40㎖씩 매회 15초간 격렬하게 진탕 혼합하여 수세를 반복한다.

(수세액에 페놀프탈레인시액으로 알칼리의 반응을 나타내지 않을 때까지 행한다)

Ⓒ 탈수：분액깔때기를 수분간 방치해서 최후의 물 1방울까지 제거한다. 이 벤젠층에 산화방지제로서 소량의 디부틸히드록시톨루엔을 가한다.

Ⓓ 용제제거：상기의 벤젠중 50㎖를 100㎖ 증류플라스크에 정확히 취해 약 45℃의 수욕상에서 수류펌프의 감압하에 재빠르게 증발시킨다. 불활성가스로 플라스크 내부를 건조한다.

Ⓔ 시험용액의 조제：잔류물에 직접 클로로포름을 피펫으로 가해서 1㎖중에 비타민A가 10～20단위가 되도록 희석하여 일정용량으로 한다.

㉰ 시험조작

시험용액 0.3㎖와 클로로포름 0.3㎖를 정확히 셀에 취하여 정색용액 3㎖를 가한다. 대조셀에 클로로포름 0.6㎖를 정확히 취한 다음 정색용액 3㎖를 첨가한 후 약 5～20초 사이에 파장 620㎚에서 흡광도를 측정한다.

[검량선의 작성]

표준비타민A를 위의 방법에 따라 처리한다. 클로로포름에 녹여서 1㎖중의 비타민의 2, 4, 6 및 10㎍을 함유하는 용액을 조제한다. 계속해서 조제한 표준용액마다 시험용액의 비타민A의 측정에 따라 조작한다.

표준용액으로부터 구한 흡광도로 검량선을 작성하고 함량을 구한다.

[계  산]

시험용액의 흡광도와 검량선으로부터 구한 시험용액 1㎖중의 비타민A의 양을 N㎍이라고 하면,

[eqn: rm시료중의 비타민A(㎍/100g)=N×V×{100}over{검체채취량(g)}×2]           [계산식]

V：시험용액 전량(㎖)

② 고속액체크로마토그래피에 의한 정량법

㉮ 시약

Ⓐ 무알데히드에탄올：에탄올(특급) 1ℓ에 50% 수산화칼륨용액 5㎖ 및 아연분말 5g을 가해 약 2시간 환류후 증류한다. 단, 초류액 및 마지막 유액 각 10%는 버린다.

Ⓑ 무수황산나트륨：무수황산나트륨(특급)을 2시간 이상 120℃에서 가열한 후 데시케이터 방냉한 후 보관한다.

㉯ 표준용액의 조제

비타민A아세테이트 결정을 비누화시켜 비타민A 알코올로 하여 국제단위(I.U) 또는 ㎍단위로 환산한다. 이를 이소프로판올(특급)로 희석하여 각각 1.0㎖중 5, 25, 50 IU가 함유되도록 한다. 사용시 조제한다.

㉰ 시험용액의 조제

일반적으로 비타민A 20～30IU(6～9㎍)에 상당하는 시료를 정밀히 달아 환저플라스크에 넣는다.

에탄올 30㎖ 및 10% 피로갈롤에탄올용액 1㎖를 가하여 잘 섞은 후 수산화칼륨용액(9→10) 3㎖를 가해 환류냉각기를 부착하여 비등수욕중에서 30분간 비누화시킨다. 신속히 냉각하여 실온으로 한 후 물 30㎖를 가해 갈색분액깔때기에 옮긴다. 플라스크는 물 10㎖로 씻고 이어서 석유에테르(특급) 30㎖로 씻은 후, 씻은 액은 분액깔때기에 합하여 잘 흔들어 혼합하여 방치한 후 물층을 별도의 갈색분액깔때기에 옮긴다. 물층은 석유에테르 30㎖씩으로 2회 추출하고, 전 석유에테르추출액을 합하여 물 10㎖ 1회, 이어 50㎖ 씩으로(페놀프탈레인시액으로 정색이 되지 않을 때까지) 씻는다. 분액깔때기중에서 물을 충분히 분리한 석유에테르층을 취하여 무수황산나트륨을 가해 탈수하고 석유에테르층을 갈색플라스크에 옮긴다. 이어 황산나트륨을 석유에테르 10㎖씩으로 2회 씻고, 씻은 액을 앞의 플라스크에 가한다. 석유에테르추출액을 모두 합하여 40～50℃에서 감압건고한 후 잔류물을 이소프로판올(특급)으로 녹여 1.0㎖로 한 것을 시험용액으로 한다.

㉱ 시험조작

Ⓐ 고속액체크로마토그래피 조건

- 칼럼：역상분배형

- 이동상：에탄올：물(95：5)

- 유속：0.5㎖/min

- 검출기：형광검출기(여기파장 340㎚, 측정파장 460㎚)

Ⓑ 정량시험

시험용액 및 표준용액을 각각 20㎕씩 주입하여 얻은 표준용액의 피크 면적 또는 높이에 의해 구한 검량선을 사용하여 시험용액의 비타민 A의 농도(I.U/㎖)를 구하고, 다음 식에 의해 검체중 비타민 A의 함량(I.U/100g)을 산출한다.

[eqn: rm비타민(IU/100g)=S×{a-b}over{검체채취량(g)}×100][계산식]

S：시험용액중의 비타민 A의 농도(I.U/㎖)

a：시험용액의 전량(㎖)

b：시험용액의 희석배수

(2) 비타민B1

① 티오크롬 형광법

㉮ 시약

Ⓐ 효소용액：사용 시 다카디아스타제 0.5g에 0.1N 염산 0.5㎖ 및 물 10㎖를 가하여 용해한 후 여기에다 산성백토 0.2g을 첨가하여 30초간 진탕 혼합하여 이것을 여과 또는 원심분리해서 그 상등액을 사용한다.

Ⓑ 25% 염화칼륨 염산용액：0.1N 염산에 염화칼륨을 25%의 비율로 녹인다. 결정이 석출하면 가온하여 완전히 녹여 사용한다.

Ⓒ 퍼무티트：50～80메쉬의 퍼무티트를 플라스크에 취해 약 4배의 열탕을 가해서 혼합, 정치한다. 상등액을 경사하여 버린다. 이 조작을 수회 반복하여 상등액이 거의 깨끗해질 때까지 행한다. 다음에 3%의 초산 약 4배량으로 전과 동일하게 2회 씻는다. 다시 25% 염화칼륨 염산용액을 약 3배량 가해서 비등수욕중 약 25분간 저어주면서 처리한다. 또 다시 3% 초산으로 2회 씻어내고 수세의 조작을 반복한다. 이 세액에 5% 질산은용액 2～3방울을 가해서 백탁되지 않을 때까지 행한다. 이것을 약 60℃에서 건조해서 보존한다. 다만, 퍼무티트 외에 엠버라이트 IRC 50을 사용할 수 있다.

Ⓓ 산화제

(제1법) 페리시안․수산화나트륨용액 : 1% 페리시안용액 4㎖를 15% 수산화나트륨으로 녹여 100㎖로 한다. 사용 전 4시간 이내에 제조한다.

(제2법) 브롬시안용액

브롬시안용액 : 특급의 브롬시안 4% 용액, 본액을 냉장고에 보존하여 그날 사용한다.

Ⓔ 무수황산나트륨：형광이 없는 것

Ⓕ 이소부탄올：무형광의 시판품을 사용하든가 형광이 인정되면 재증류 정제해서 사용한다.

Ⓖ 비타민B1표준용액：표준품을 사용한다. 염산산성의 물로 희석해서 1㎍/㎖로 한다.

㉯ 장치 및 기구

Ⓐ 칼럼관

경질 유리제 흡착관의 S부의 밑에 소량의 유리솜을 채워 넣어 물을 가득넣고 별도로 퍼무티트 1.3～1.5g을 비커에 취한다.

물 약 20㎖를 가해 약하게 진탕해서 퍼무티트에 부착하고 있는 기포를 제거한 다음 물과 함께 전부를 흡착관에 유입, 계속해서 3% 초산 10㎖ 및 물 20㎖를 각각 1분간에 1㎖의 유속으로 통해서 조정을 해 놓는다.

Ⓑ 추출병：50～150㎖까지 10㎖마다 표선을 그려놓은 것이 쓰기에 편리하다.

Ⓒ 형광광도계：분광식의 여기파장을 375㎚, 수광부의 형광선택파장을 420㎚에 조정해 쓴다.

㉰ 시험용액의 조제

Ⓐ 추출

검체 1～10g을 추출병 또는 100㎖의 메스플라스크에 취해 물 약 20㎖를 가하여 혼합해 0.1N 염산 또는 0.1N 황산 약 50㎖를 가하여 잘 섞은 후 끓는 수욕상에서 30분간 가열 추출한다.

Ⓑ 효소분해

추출액은 약 50℃에 냉각시켜 놓고 4M 초산나트륨액을 적가해서, pH를 약 4.5에 조정한다. 다시 한번 효소용액 약 2㎖를 가해서 40～50℃에 2～3시간 보온하든가 또는 톨루엔 5～6방울을 가해 37～40℃의 항온기에 넣어서 하룻밤을 방치한다. 다음에 15분간 비등수욕 중에서 온침한다. 냉각후 물을 가해서 100㎖로 하고 원심분리하든가 또는 여과해서 상등액을 취한다. 이것을 시료용액으로 한다.

Ⓒ 흡착

시료용액(pH 4.5)의 일정량(비타민B1으로서 약 5μg을 함유하는 액량)을 칼럼에 조용히 주입한다. 1분간 1㎖의 유속으로 흡착케 한다. 계속해서 pH 4.5의 염산 5㎖로 칼럼의 R부의 내면을 씻어버린다.

Ⓓ 수세

흡착이 끝났다고 생각되면 공존하는 형광물질을 제거한다. 칼럼에 끓는 물을 주입하고 1분간 3～4㎖(1초간에 약 1방울)의 유속으로 흡착층을 씻는다. 세액을 형광이 나타나지 않을 때까지 물로 계속 씻어준다.

Ⓔ 탈착

수세가 끝나고 칼럼 하부의 수기를 25㎖의 메스플라스크에 교환 칼럼이 따뜻할 동안에 비등 25% 염화칼륨염산용액 10㎖를 가한다. 1초간 1방울씩 나누어 액이 적하되도록 조절한다. 탈착액을 받아서 용출액이 퍼무티트의 상단까지 달하면 재차 비등용출액 8㎖를 주입해 동일하게 조작한다. 최후에 동액 7㎖를 주입해서 탈착액의 전량을 약 25㎖로 하여 뚜껑을 닫아 놓는다. 뒤이어 메스플라스크를 실온에 방치한다. 냉각후 물을 가해서 정확히 25㎖로 하여 시험용액으로 한다.

㉱ 시험조작

(제1법 : 페리시안에 의한 산화 및 티오크롬의 추출)

시험용액을 5㎖씩 T1, T2 및 T₃3개의 50㎖ 공전시험관에 나누어 취한다. T1을 첨가시험용, T2를 주시험용, T3를 공시험용으로한다. T1에는 비타민 B1표준액 1㎖ (비타민 B1 1㎍)를, T2 및 T3에는 물 1㎖를 가한다. 계속해서 T1 및 T2에는 페리시안․수산화나트륨용액 3㎖를 가한 후 혼합한다. 이소부탄올 15㎖를 가해 밀전하여 1분간 격렬히 진탕 혼합한다. T3에는 30% 수산화나트륨용액 3㎖를 가한 후 혼합한다. T1, T2와 같이 이소부탄올을 가해 진탕 혼합한다. T1, T2, T3의 시험관을 정치하든가 또는 1,000～1,500rpm으로 2분간 원심분리해서 상등액의 이소부탄올을 피펫으로 별도의 시험관에 분취한다. 계속해서 무수황산나트륨 1～2g을 소량씩 첨가해서 진탕 혼합한 후 정치해서 깨끗한 이소부탄올을 얻는다.

(제2법 : 브롬시안화에 의한 산화 및 티오크롬의 추출)

시험용액을 5㎖씩 T1, T2 및 T3 3개의 50㎖ 공전시험관에 나누어 취한다. T1을 첨가시험용, T2를 주시험용, T3를 공시험용으로 한다. T1에는 비타민B1표준액 1㎖(비타민B1, 1μg)을, T2 및 T3에는 물 1㎖를 가한다. 계속해서 T1 및 T2에는 브롬시안용액 3㎖를 가해서 혼합한 후 30% 수산화나트륨용액 3㎖를 혼합한다.

이소부탄올 15㎖를 가해 밀봉하여 1분간 격렬히 진탕 혼합한다. T3에는 30% 수산화나트륨용액 3㎖를 처음 가한 후 브롬시안용액을 혼합한다. T1, T2와 동일 이소부탄올을 가해 진탕 혼합한다. T1, T2, T3의 시험관을 정치하든가 또는 1,000～1,500rpm으로 2분간 원심분리해서 상등액의 이소부탄올을 피펫으로 별도의 시험관에 분취한다. 계속해서 무수황산나트륨 1～2g을 소량씩 첨가해서 진탕 혼합한 후 정치해서 깨끗한 이소부탄올을 얻는다.

Ⓐ 비형광측정 및 계산：전항의 이소부탄올액을 형광셀에 넣어 형광도를 측정한다.

[계산식]

검체중의 비타민B1(mg/100g)

＝ D×[eqn: rm { T_2 `-T_3} over { T_1`-T_2} ×{ 25} over {5}×{V_2} over {V_1}×{100} over {검체의~채취량(g)}×{1} over {1000}]

D ：첨가 비타민B1(㎍)

V1：시료용액의 채취량(㎖)

V2：시료용액 전량(㎖)

② 고속액체크로마토그래피에 의한 정량법

㉮ 시약

Ⓐ 4M 초산나트륨용액：5.44g의 초산나트륨을 물에 녹여 10㎖로 한다.

Ⓑ 다카디아스타제용액：다카디아스타제를 물에 녹여 2%로 하여 퍼무티트(Purmutit)칼럼에 넣고 다카디아스타제중에 존재하는 비타민B1을 제거한 후 사용한다. 사용 시 제조한다.

Ⓒ 페리시안화칼륨‧수산화나트륨용액：수산화나트륨 30g을 물에 녹여 200㎖로 하고 이에 페리시안화칼륨 20㎎을 녹인다. 사용 시 제조한다.

㉯ 표준용액의 조제

순도가 보증된 비타민B1염산염을 비타민B1으로 0.01～1.0㎎/㎖가 되도록 10% 삼염화초산용액에 녹인다. 이 비타민B1용액(S ㎎/㎖)을 4M 초산나트륨을 2% 다카디아스타제 용액을 각각 20：3：1의 비율로 혼합한 용액을 표준용액으로 한다.

㉰ 시험용액의 조제

Ⓐ 일반적 시료

검체 1g을 정확히 달아 10% 삼염화초산용액 5㎖를 넣고 균질기로 균질화시킨다.

균질화한 용액을 10% 삼염화초산용액으로 10㎖로 한 후 고속원심분리관에 넣고 9,000rpm에서 30분간 원심분리한다. 이 상징액 200㎕를 시험관에 취하여 4M 초산나트륨용액 30㎕를 가한다(pH 4.5～4.7). 이에 2% 다카디아스타제 용액 10㎕를 주입하고 잘 교반하면서 37℃에서 8～10시간 방치하여 시험용액으로 한다.

Ⓑ 난용성 비타민B1 염류 및 비타민B1 유도체 강화시료

(2) 비타민B1 ① 브롬시안에 의한 티오크롬형광법의 시험용액의 조제에 따라 전처리된 시험용액을 사용한다.

㉱ 시험조작

Ⓐ 고속액체크로마토그래피 조건

- 칼럼：비타민B1 분리용(Polyglycerylmethacrylate, 구상, 15㎕) 또는 이와 동등한 것

- 이동상：0.1M 제1인산나트륨용액

- 유속：0.7㎖/min

-반응액：페리시안화칼륨‧수산화나트륨용액(유속：0.7㎖/min)

- 검출기：형광검출기(여기파장：375㎚, 측정파장：450㎚)

Ⓑ 정량시험

표준용액과 시험용액을 각각 50㎕씩 고속액체크로마토그래프에 주입하고, 칼럼에서 분리 용출시킨 비타민B1을 반응액 송액펌프에서 보내진 반응액과 자동적으로 혼합시켜 형광물질(티오크롬)으로 변환한다. 이 형광물질을 형광분광광도계로 보내 얻어진 표준용액 피크의 면적 또는 높이에 의해 구한 검량선을 이용하여 시험용액의 비타민B1의 농도(㎍/㎖)를 구하고, 다음 식에 의해 검체중 비타민B1의 함량(㎎/100g)을 계산한다.

[계산식]             [eqn: rm비타민B_1{}의~양(mg/100g)=S×{(a-b)}over{검체채취량(g)}×{100}over{1,000}]

S：시험용액중의 비타민B1의 농도(㎍/㎖)

a：시험용액의 전량(㎖)

b：시험용액의 희석배수

(3) 비타민B2

① 루미플라빈 형광법

㉮ 시약

Ⓐ 클로로포름：형광이 없는 것 형광이 있는 것은 유리제의 증류장치를 써서 재증류한다. 갈색병에 넣어 물을 포화시켜 냉암소에 보존한다.

Ⓑ 비타민B2표준용액：비타민B2표준품을 온탕에 녹여서 40㎍/㎖로 한다. 그 100㎖에 초산 수방울을 가해서 갈색 공전병에 넣어 냉장고에 보존한다. 사용 시 희석해서 2㎍/㎖의 액을 만든다. 밝은 곳에 내놓지 않도록 주의한다.

㉯ 장치 및 기구

Ⓐ 광분해장치：형광등에 반사경을 달아 시험용액을 양측으로부터 조사하든지 또는 상부에 형광등이 붙어 있는 측면에는 광을 난반사하도록 한 상자모양의 것도 좋다.

Ⓑ 용기：갈색 유리기구를 쓴다.

Ⓒ 형광광도계：여기파장 430㎚, 측정파장 530㎚

㉰ 시험용액의 조제

검체의 일정량을 취해 소량의 물을 가해서 균질기 또는 막자사발에 넣어 마쇄한다. 지방이 많은 것은 미리 탈지한다. 이것에 물 수 ㎖～수십 ㎖를 가해 수욕중에서 혼합 15～20분간 추출한다. 대부분의 것은 이 추출법으로 충분히 추출된다. 또는 비타민B1 ㉰ 시험용액의 조제 Ⓑ 효소분해까지의 시험용액을 그대로 사용할 수 있다. 추출액은 냉각 후 1㎖중 0.05㎍이 되도록 일정 용량으로 하여 시험용액으로 한다.

㉱ 시험조작

Ⓐ 광분해

시험용액 일정량(0.2～1μg 비타민 B2를 함유하는 용액)을 3개의 공전시험관에 취한다. 그 한 개를 첨가시험용으로 해서 비타민 B2의 일정량(0.2～1μg)을 함유하는 용액을 가한다. 다른 두개 T2 및 T3는 T1에 가한 비타민B2용액과 동량의 물을 가해서 T1, T2, T3를 같은 용량으로 한다. 이 시료용액에 1N 수산화나트륨액을 같은 양 가해 혼합한 후 T1(첨가시험) 및 T2(주시험)를 광분해 장치로써 1시간 광분해 한다. T3(공시험)는 1시간 암소에 둔다. 광분해가 끝나면 각 시험관에 초산을 0.5㎖씩 가한다.

Ⓑ 산화 및 추출

광분해를 끝낸 산성용액에 4% 과망간산칼륨용액 0.5㎖를 가해서 1분간 방치한다(필요하면 초산을 소량 가한다). 계속해서 3% 과산화수소용액을 적가해서 탈색하고 클로로포름 10㎖씩을 가해서 뚜껑을 닫고 격렬히 2분간 진탕 혼합한다. 필요하면 원심분리를 행하고, 클로로포름층을 분취한다.

Ⓒ 측정 및 계산

클로로포름층을 측정셀에 옮기고 T1(첨가시험), T2(주시험), T3(공시험)의 형광광도를 읽어 T1, T2, T3로 한다. 검체중의 비타민B2의 함량을 다음 식에 따라 구한다.

[계산식]

[eqn: rm비타민B_2{}의~양(mg/100g)=D×{{T_2}-{T_3}}over{{T_1}-{T_2}}×{V_2}over{V_1}×{100}over{검체의채취량(g)}×{1}over{1,000}]

D ：첨가 비타민B2(㎍)

V1：시험용액 채취량(㎖)

V2：시험용액 전량(㎖)

② 고속액체크로마토그래피에 의한 정량법

㉮ 시약

Ⓐ 메탄올：고속액체크로마토그래피용

Ⓑ 10mM NaH2PO4 용액：1N 수산화나트륨용액으로 pH 5.5로 조정한다.

㉯ 표준용액의 조제

Ⓐ 리보플라빈 표준용액：(3) 비타민B2 ① 루미플라빈 형광법과 동일하게 조제하고 사용 시 물로 희석하여 0.2㎕/㎖의 용액으로 만든다.

Ⓑ FMN(Flavin mononucleotide)표준용액：FMN을 물에 녹여 0.2㎕/㎖(리보플라빈으로 환산)의 용액으로 만든다.

Ⓒ FAD(Flavin adeninedinucleotide)표준용액：FAD를 물에 0.5㎕/㎖(리보플라빈으로 환산)의 용액으로 만든다.

㉰ 시험용액의 조제

검체 일정량을 달아 소량의 물을 가해 균질기 또는 막자사발에서 가능한 한 미세하게 분쇄하고 지방이 많은 경우에는 미리 탈지한다. 이에 물을 가해 수욕중(70～80℃)에서 잘 혼합하여 12～20분간 추출한다. 추출액은 식힌 후 1㎖중 비타민B2 0.05～0.5㎍이 되도록 일정용량으로 하여 시험용액으로 한다.

㉱ 시험조작

Ⓐ 고속액체크로마토그래피 조건

- 칼럼：역상분배형(μ-Bondapak C18, Micropak-CH, Cosmosil 5 C18, Develesil ODS 등) 또는 이와 동등한 것

- 이동상：메탄올：10mM NaH2PO4용액(pH 5.5) (35：65)

- 유속：0.8㎖/min

- 검출기：형광검출기(여기파장：445㎚, 측정파장：530㎚)

Ⓑ 정량시험

시험용액 및 각 형의 표준용액을 각 10㎕씩 주입하여 앞의 조건에서 시험한다. 표준용액 각 형의 피크 면적 또는 높이에 의해 구한 검량선을 사용하여 시험용액의 비타민B2의 농도(㎍/㎖)를 구하고, 다음 식에 의해 검체중 비타민B2 함량(㎎/100g)을 산출한다.

[eqn: rm비타민B_2{(리보플라빈, FMN, FAD)}(mg/100g)=S×{a×b}over{검체채취량(g)}×{100}over{1,000}]  [계산식]

S：시험용액중의 비타민B2의 농도(㎍/㎖)

a：시험용액의 전량(㎖)

b：시험용액의 희석배수

(4) 비타민C

① 2.4-디니트로페닐하이드라진(DNP)에 의한 정량법

㉮ 시약

Ⓐ 메타인산-초산용액：메타인산 15g을 초산 40㎖ 및 물 200㎖로 잘 진탕 혼합하여 녹여서 물을 가해 250㎖로 한다. 이 용액은 냉장고에 보관하면 1주간 사용할 수 있다.

Ⓑ 묽은메타인산-초산용액：메타인산-초산용액을 같은 양의 물로 혼합한다. (사용 시 조제)

Ⓒ 20% 메타인산용액：냉장고에 보존한다.

Ⓓ 10% 메타인산용액：냉장고에 저장, 2주간 사용할 수 있다.

Ⓔ 5% 메타인산용액：사용할 때 조제한다.

Ⓕ 인도페놀용액：2,6-디클로로페놀 인도페놀나트륨염 0.2g을 더운물에 녹여 100㎖로 한다. 필요하면 여과한다. 본 용액은 냉장고에 보존하고 2주간 사용할 수 있다.

Ⓖ 메타인산-티오요소용액：10% 메타인산용액 50㎖에 티오요소 2g을 녹인다. 물을 가해 100㎖로 한다(사용 시 조제).

Ⓗ 디니트로페닐하이드라진용액：2, 4-디니트로페닐하이드라진 2g을 9N 황산액 100㎖에 녹인다. 유리여과기로 여과한다. 본 용액은 냉장고에 보존하면 2주간 사용할 수 있다.

Ⓘ 비타민C 표준용액

비타민C 표준품 100㎎을 정밀히 단다. 메스플라스크에 넣어 5% 메타인산용액에 녹여서 100㎖로 한다.

그 0.25, 0.5, 1.0, 1.5, 2.0 및 2.5㎖를 각각 메스플라스크에 취해 5% 메타인산용액을 가해서 100㎖로 한다(사용 시 조제).

㉯ 시험용액의 조제

조작은 모두 신속히 행한다.

추  출

검체의 일정량을 정밀히 단다. 정확히 같은 양의 메타인산-초산용액을 잘 혼합해서 균등한 죽 상태로 한다. 환원형 비타민C로서 1～5㎎ 함유되도록 균등한 죽상태의 일정량(W g)을 100㎖의 메스플라스크에 옮기고 묽은메타인산-초산용액으로 100㎖로 한다. 이 용액을 여과하여 처음의 수 ㎖를 제거해서 그 후의 여액을 취하거나 또는 원심분리해서 상등액을 취하여 시험용액으로 한다.

㉰ 시험조작

Ⓐ 산화

시험용액 2㎖를 시험관 T1, T2 및 T3에 취해 T1에 인도페놀용액 1방울을 혼합해서 이것이 적색을 나타내는지 확인하고, T1, T2 및 T3에 메타인산-티오요소용액 2㎖씩 가한다.

Ⓑ 오사존의 생성：시험관 T1 및 T2에 디니트로페닐하이드라진용액 1㎖씩을 가해 37℃(±0.5℃) 항온수욕중에서 정확히 3시간 방치하고 T3와 함께 얼음물 중에 침적한다.

Ⓒ 오사존의 용해

얼음물중에서 냉각하면서 T1, T2 및 T3에 85% 황산용액 5㎖를 조금씩 적가해서 1분간 얼음물 중에서 내용액을 잘 혼합 냉각한다. 다음에 차가운 상태에서 T3에 디니트로페닐하이드라진용액 1㎖를 혼합한다. T1, T2 및 T3의 내용액을 재차 혼합한 후 얼음물로부터 꺼내서 실온에서 30～40분간 방치한다.

Ⓓ 비색：T1 및 T2의 내용액에 대해서 510～540㎚에서 흡광도를 측정하고, T1 및 T2 로 한다. 대조액은 T3로 한다.

Ⓔ 검량선의 작성：비타민C 표준용액의 각 2㎖씩을 시험관에 취하고 위의 시험조작 Ⓐ～Ⓓ에 따라서 조작한다. 각각 흡광도를 구하고 검량선을 그린다.

Ⓕ 계산：시험용액 2㎖중의 총 비타민C량 및 산화형 비타민C량을 각각의 환원형 비타민C량(㎍)으로 나타낸 수치를 검량선에서 찾아서 T1 및 T2에 대응하는 점으로부터 구하여 C1 및 C2로 한다. 검체중의 비타민C함량은 다음 식으로 구한다.

[계산식]

[eqn: rm총~비타민C(mg/100g)={C_1}over{1,000}×50×{검체채취량×2}over{W}×{100}over{검체채취량(g)}]

[eqn: rm산화형비타민C(mg/100g)={C_2}over{1,000}×50×{검체채취량×2}over{W}×{100}over{검체채취량(g)}]

산화형비타민C (㎎/100g)＝총 비타민C(㎎/100g)-산화형비타민C(㎎/100g)

② 인도페놀적정법에 의한 정량

㉮ 시약

인도페놀용액：미리 탄산수소나트륨 약 50㎎을 더운물 약 150㎖에 용해하고 여기에 2, 6-디클로로페놀 인도페놀나트륨염 약 50㎎을 용해시키고 냉각 후 물로 200㎖로 한다. 여과 후 차광하여 냉소에 저장하면 일주간 사용할 수 있다. 다만, 다음 방법에 따라 사용할 때 적정한다.

[적   정]

비타민C표준품 100㎎을 정밀히 달아서 500㎖의 메스플라스크에 넣어 묽은 메타인산-초산용액으로 500㎖로 한다. 그 5㎖를 정밀히 취하여 묽은 메타인산-초산용액 5㎖를 가하고 인도페놀용액으로 액이 적어도 5초간 적색이 지속될 때까지 적정한다. 여기에 적정된 인도페놀용액의 소비량을 T ㎖로 한다.

㉯ 시험조작

조작은 모두 신속히 행한다.

Ⓐ 환원형비타민C의 적정

디니트로페닐하이드라진법에서 조제한 시험용액 10㎖를 삼각플라스크에 정확히 취하여 즉시 인도페놀용액으로 액이 적어도 5초간 적색이 지속될 때까지 적정한다.

이때 적정된 인도페놀용액의 소비량을 S㎖로 한다.

Ⓑ 계산：검체중의 환원형비타민C는 다음 식에 의해 구한다.

[계산식]

[eqn: rm환원형비타민C(mg/100g)=Amg×{S}over{T}×{검체채취량×2}over{W}×{100}over{검체채취량(g)}]

A㎎：인도페놀용액 T㎖에 대응하는 아스코르빈산량

③ 고속액체크로마토그래피에 의한 정량법

㉮ 시약

Ⓐ 10% 메타인산용액：메타인산 10g을 물에 녹여 100㎖로 한다. 불용물이 생기는 경우 여과하여 사용한다. 냉장고에서 일주일까지 보관할 수 있다.

Ⓑ 5% 메타인산용액：10% 메타인산용액을 물로 2배 희석한다. 사용시 조제한다.

㉯ 표준용액의 조제

아스코르빈산 10.0㎎을 정밀히 달아, 5% 메타인산용액에 녹여 100㎖로 한 것을 표준원액(100ppm)으로 한다. 필요한 경우 표준원액에 5% 메타인산용액을 넣어 원하는 농도로 희석하여 사용한다. 사용 시 조제한다.

㉰ 시험용액의 조제

검체 일정량(비타민C함량이 50㎎/100g 이상인 경우 2g 정도, 10㎎～50㎎/100g인 경우 5～10g 정도를 검체로 한다)을 정확히 달아, 동량의 10% 메타인산용액을 가하여 10분간 현탁시킨 후 적당량의 5% 메타인산을 넣어 균질화한다. 균질화된 시료를 100㎖ 메스플라스크에 옮기고 소량의 5% 메타인산용액으로 용기를 씻은 후 메스플라스크에 합하여 100㎖로 한다. 그 후 3,000rpm에서 10～15분간 원심분리를 행하여 상등액을 취하고 5% 메타인산용액으로 적당히 희석하여 시험용액으로 한다.

㉱ 시험조작

Ⓐ 고속액체크로마토그래피 조건

- 칼럼：역상분배형(Jascopack Fine Sil-NH2, Lichrosorb NH2, 조건을 달리하며,  Zipax SAX, Vydac SAX. Partisil-10SAX, μ-Bondapak C18, μ- Bondapak/CN, Pormaphase CPS 등을 사용할 수 있다) 또는 이와 동등한 것

- 이동상：0.05M KH2PO4/아세토니트릴(60:40)

- 유속：1.0㎖/min

- 검출기：UV 254㎚

Ⓑ 정량시험

시험용액 및 표준용액을 각각 10㎕씩 주입하여 얻은 피크의 넓이 또는 높이를 구하여 검량선을 작성한 후 시험용액의 비타민C의 농도(㎍/㎖)를 구하고, 다음 식에 의해 검체중 아스코르빈산의 함량(㎎/100g)을 산출한다. L-아스코르빈산 나트륨으로 환산하는 경우에는 L-아스코르빈산량에 계수 1.125를 곱한다.

[계산식][eqn: rm비타민C의~함량(mg/100g)=S×{a×b}over{검체채취량(g)}×{100}over{1,000}]

S：시험용액중의 아스코르빈산의 농도(㎍/㎖)

a：시험용액의 전량(㎖)

b：시험용액의 희석배수

(5) 니코틴산(나이아신)

① 케니히 반응에 의한 비색법

㉮ 시약

Ⓐ 포화황산아연용액：황산아연(ZnSO4‧7H2O) 800g을 물에 녹여서 1l로 한다.

Ⓑ 브롬시안용액：특급 브롬시안을 물에 녹여 10%로 한다.

Ⓒ 니코틴산 표준용액：니코틴산 표준품 약 100㎎을 정밀히 달아 100㎖ 메스플라스크에 넣고 10N 황산액 1㎖를 가하여 녹인 후 물로 100㎖되게 한다. 이것을 원액으로 해서 차광하여 냉장고에 보존한다. 사용 시 그 0.25, 0.5, 1.0, 2.0 및 2.5㎖를 각각 취해 물을 가하여 100㎖로 희석한다.

Ⓓ 파라아미노 아세토페논용액：파라아미노 아세토페논 2g을 소량의 염산에 녹여서 물을 가하여 100㎖로 한다.

㉯ 시험용액의 조제

Ⓐ 가수분해

100㎖의 비커에 니코틴산 400㎍ 상당량의 검체를 취한다. 6N 염산액 20㎖를 가해 비등수욕중에 60분간 침출하여 가수분해 한다. 이것을 흐르는 물로 냉각시켜 100㎖ 메스플라스크에 옮겨 넣고 물로 100㎖로 하여 여과 또는 원심분리하여 여액 또는 상등액을 검체용액으로 한다.

Ⓑ 중화

검체 용액 25㎖를 원심 침전관에 취하고 페놀프탈레인시액 2방울을 가해서 6N 수산화나트륨액 20㎖로 미산성이 될 때까지 중화한다.

Ⓒ 탈색

이 중화액에 포화 황산아연용액 2㎖를 가해 소포제로서 아밀알콜 수방울을 가하고 다음에 수산화아연의 침전이 생길 때까지 잘 진탕 혼합하여 3M 수산화나트륨액과 1N 수산화나트륨액을 가하여 중화한다. 다음에 pH 6.5가 될 때까지 2N 황산액을 가하고 다시 물을 가하여 50㎖로 한다. 때때로 진탕 혼합하여 10분간 방치한 후 원심분리 또는 여과하여 이것을 시험용액으로 한다.

㉰ 시험조작

Ⓐ 발색

시험용액 5㎖씩을 2개의 시험관에 취하고 여기에 브롬시안용액 2㎖씩을 가하여 60～70℃의 수욕중에서 10～15분간 반응시킨다. 얼음물 중에서 냉각시키면서 한쪽에 파라아미노 아세토페논용액 1㎖를 가하여 다른 쪽을 대조액으로 하여 2개의 시험관에 물로 10㎖로 한다.

Ⓑ 비색：Ⓐ에서의 발색액은 얼음물 중에 냉각한 대로 암실에 10～15분간 방치한 후 대조액에 대하여 파장 420㎚에서 흡광도 A를 측정한다.

Ⓒ 검량선의 작성： 각 농도의 니코틴산 표준액의 1㎖를 취해 물 4㎖를 가해서 이하 정량조작 Ⓐ, Ⓑ에 따라서 검량선을 작성한다.

Ⓓ 계산：시험용액 5㎖중에 함유한 니코틴산량을 검량선에 나타난 A에 대응하는 점으로부터 구하여 X(㎍)로 한다.

[계산식]

[eqn: rm검체중의~총~니코틴산(mg/100g)=X×40×{100}over{검체채취량(g)}×{1}over{1,000}]

② 미생물학적 시험법

㉮ 시약

Ⓐ 니코틴산 보존용액

미리 건조하여 데시케이터 건조한 니코틴산 표준품을 에탄올에 용해하고 그 1㎖가 니코틴산 100㎍을 함유하게 한다. 이 용액은 냉소에 보존한다.

Ⓑ 니코틴산 표준용액

니코틴산 보존용액을 물로 희석하여 그 1㎖가 니코틴산 0.1㎍을 함유하도록 한다. 사용할 때 조제한다.

Ⓒ 카제인 산분해 용액

배지작성에 대하여 각 비타민, 무기염류, 카제인 산분해물 등은 적당한 농도의 액을 만들어 냉장고 중에 보존하여 두면 편리하다. 이 보존액에 잡균이 혼합되지 않게 하고, 보존액에서 배지를 작성함에 있어 각 비타민의 보존액에 다른 비타민이 혼입되지 않게 특히 주의한다. 배지를 만들 때에는 일반적으로 각 성분을 혼합, 용해한 다음에 10% 염산용액 또는 수산화나트륨용액을 사용하여 pH 3.5로 조정하고 약 20분간 비등수욕상에서 가온하고, 냉각 후 여과하여 물을 가해서 배양시의 2배 농도의 배지를 작성한다. 다음에 공통성분의 염류용액과 카제인산분해액의 제법을 참고한다.

Ⓓ 아데닌, 구아닌, 우라실 용액

아데닌황산염, 구아닌염산염 및 우라실 각 0.1g을 20% 염산용액 5㎖에 가열하면서 용해하고 냉각 후 물을 가하여 100㎖로 하고 톨루엔 소량을 가하여 약 10℃에서 보존한다.

Ⓔ 시스틴, 트립토판용액

L-시스틴 2g 및 L-트립토판 0.5g(또는 DL-트립토판 1g)을 물 350～400㎖에 현탁하고 70～80℃에 가열하여 고형물이 용해할 때까지 20% 염산용액을 적가한다. 냉각 후 물을 가하여 전량을 500㎖로 하고 톨루엔 소량을 가하여 약 10℃에서 보존한다.

Ⓕ 비타민B1, 비타민B2, 비오틴용액

비타민B1 염산염, 비타민B2 및 비오틴을 0.02N 초산에 녹이고, 그 1㎖가 비타민B1 염산염 10㎍, 비타민B2 20㎍ 및 비오틴 0.04㎍을 함유하게 한다. 이 용액은 톨루엔 소량을 가하여 광을 피해서 냉소에 보존한다.

Ⓖ 파라아미노 안식향산, 판토텐산칼슘, 비타민B6용액

이 용액의 1㎖가 파라아미노 안식향산 10㎍, 판토텐산칼슘 20㎍ 및 피리독신 염산염 40㎍을 함유하게 25% 에탄올에 녹인다.

Ⓗ 염류용액 A 및 염류용액 B

㉠ 염류용액 A

제1인산칼륨(KH2PO4) 및 제2인산칼륨(K2HPO4) 각 5g을 물에 용해하여 전량을 100㎖로 하고 염산 1방울 및 톨루엔 소량을 가하여 보존한다.

㉡ 염류용액 B

황산마그네슘(MgSO4‧7H2O) 2g, 염화나트륨(NaCl) 0.1g, 황산제1철(FeSO4‧7H2O) 0.1g 및 황산망간(MnSO4‧4H2O) 0.1g을 물에 용해하여 전량을 100㎖로 하고 염산 1방울 및 톨루엔 소량을 가하여 보존한다.

㉯ 기초배지의 조제

카제인 산분해용액 10㎖, 시스틴, 트립토판용액 10㎖, 아데닌, 구아닌, 우라실용액 2㎖, 비타민B1, 비타민B2, 비오틴용액 2㎖, P-아미노 안식향산, 판토텐산칼슘, 비타민B6용액 2㎖, 염류용액 A 2㎖ 및 염류용액 B 2㎖를 혼합하고 여기에 포도당 4g 및 무수초산나트륨 2g을 가하여 용해하고, 10% 수산화나트륨용액으로 pH를 6～8로 조정한다. 다음 물을 가하여 전량을 100㎖로 한다. 필요하면 여과한다(또는 Niacin Assay Medium, DIFCO사 제품을 사용할 수 있다).

㉰ 접종용액의 조제

Lactobacilllus plantarum의 보존균주

물 100㎖에 효모엑기스 2g을 녹이고 여기에 포도당 0.5g, 무수초산나트륨 0.5g을 가하여 pH 6.8로 조정한 다음, 수욕상에서 10～20분간 가열하고, 여과 후 한천 1.5g을 가하고 한천이 용해될 때까지 수욕상에서 흔들어 혼합하면서 가열한다. 가열시 이 용액 약 10㎖씩을 시험관에 분주하고, 솜마개를 하고, 1㎏/㎝2에서 10분간 가압 멸균하고 시험관을 수직의 위치에 보존하여 냉각한다. Lactobacillus Plantarum ATCC, No8014의 보존균주로부터 멸균한 배지 10㎖에 접종하고 37℃에서 16～24시간 배양하고, 냉소에 보존한다. 보존균주는 매주 새로 조제한다. 1주 지난 것은 사용하여서는 아니 된다(또는 Lactobacilli agar, DIFCO사 제품을 사용할 수 있다).

㉱ 배지

기초 배지 5㎖를 함유하는 시험관에 니코틴산 1㎍을 함유하게 하고 물을 가하여 솜마개를 하고 1㎏/㎝2에서 10분간 가압 멸균하여 방냉한다(또는 Lactobacilli broth AOAC, DIFCO사 제품을 사용할 수 있다).

㉲ 접종균액

Lactobacillus plantarum의 보존균주를 멸균한 배지 10㎖에 접종하고 37℃에서 16～24시간 배양한다. 여기에서 얻은 배양액을 잘 진탕 혼합한 다음 그대로 접종균액으로 하여 사용한다.

㉳ 시험용액의 조제

시료 일정량을 적당한 크기의 플라스크에 취하고 다음의 어느 방법에 따라서 시험용액을 조제한다.

Ⓐ 염기성 물질 함량이 적은 고체 또는 반고체시료：

시료의 적어도 10배량의 1N 황산을 가하여 잘 혼합한다. 이 용액 1㎖는 니코틴산 5mg이상을 함유하여서는 아니 된다. 다음에 1N 황산으로 플라스크의 벽에 부착한 시료를 세척하여 떨어뜨린 다음 1㎏/㎝2에서 30분간 가압 추출하고, 냉각 후 1N 수산화나트륨액을 가하여 pH 6.5로 조정하고, 다음에 물을 가하여 용액 1㎖가 니코틴산 약 0.1㎍을 함유하게 희석하고, 필요하면 여과한다.

Ⓑ 염기성물질 함량이 많은 고체 또는 반고체시료

시료에 소량의 물을 가하여 잘 혼합하고, 여기에 1N 황산을 가하여 pH를 약 6으로 하고, 다음에 시료의 적어도 10배량의 1N 황산을 가하여 혼합하고 이하 Ⓐ에 따라서 조제한다.

Ⓒ 액체시료

시료에 1N 황산 또는 1N 수산화나트륨액을 가하여 pH를 약 6으로 조정하고 이하 Ⓑ에 준하여 조제한다.

㉴ 시험조작

Ⓐ 산도적정법에 의한 정량

니코틴산 표준용액의 계열을 만들기 위하여 시험관 2개씩에 니코틴산 표준용액 0, 0.25, 0.5, 0.75, 1, 1.25, 1.5, 1.75 및 2㎖를 취하고 각 시험관에 기초 배지 5㎖ 및 물을 가하여 전량을 10㎖로 한다. 따로 시험용액의 계열을 만들기 위하여 시험관 3개씩에 시험용액 0.3, 0.6 및 0.9㎖를 가하고 다음에 각 시험관에 기초 배지 5㎖ 및 물을 가하여 전량을 10㎖로 한다. 양 계열의 시험관의 내용물은 잘 흔들어 혼합하고 솜마개를 하든가 또는 뚜껑을 한 다음 1㎏/㎝2에서 10분간 가압 멸균하고, 냉각 후 각 시험관에 접종액 7㎕씩을 무균적으로 접종하고 37℃에서 72시간 배양기에 넣어서 배양한다. 배양 후 각 시험관 중에 생긴 산을 0.1N 수산화나트륨액으로 적정한다(지시약：0.1% 페놀프탈레인시액).

니코틴산 표준계열의 각 단계에 따른 측정치의 평균치를 각 시험관에 가한 니코틴산의 ㎍수에 대한 검량선을 작성한다. 다음에 이 검량선을 사용하여 내삽법에 따라서 시료 계열의 각관중의 니코틴산 함량을 구한다. 이 때의 측정치가 0.15㎍ 이상 및 0.025㎍이하의 것이 있으면 제외하고 남은 각 시험관에 대해서 시험용액 1㎖에 대한 니코틴산의 함량을 구한다. 6개 이상의 관으로부터 얻어진 각각의 치가 그의 평균치보다 ±10%를 초과하는 것이 없는 것을 확인한 다음에 다시 이것만의 평균치를 구하고, 다음에 시료중의 니코틴산 함량을 산출한다.

Ⓑ 탁도 측정에 의한 정량

탁도 측정에 의한 정량법은 산도측정에 비하여 정밀도는 약간 낮지만 결과를 신속히 알게 되는 이점이 있다. 니코틴산의 검량선을 0～0.1μg/4㎖로 하고, 시험용액 계열의 니코틴산 함량도 거기에 따라서 감해지면 좋다. 그러나 균의 배양시간은 20～40시간으로 한다. 탁도는 570～650㎚에서 흡광도를 측정한다.

(6) 비타민E

① 고속액체크로마토그래피에 의한 정량

㉮ 시약

Ⓐ 에탄올：에탄올(특급) 1ℓ에 50% 수산화나트륨용액 5㎖ 및 아연분말 5g을 가해 약 2시간 환류 후 증류한다.

Ⓑ 헥산：스펙트로분석용

Ⓒ 무수황산나트륨：무수황산나트륨(시약특급)을 120℃에서 2시간이상 가열시킨 후 데시케이터(실리카겔)에서 방냉하고 밀전하여 보존한다.

Ⓓ α-, β-, γ-, δ-토코페롤：d-α-, d-β-, d-γ-,  d-δ-토코페롤 순품

㉯ 표준용액의 조제

Ⓐ 토코페롤동족체 표준용액

토코페롤 동족체(α-, β-, γ-, δ-토코페롤)을 각각 100㎎씩 정밀히 달아 헥산을 가해 녹여 100㎖로 한 후, 각각의 5㎖를 취하여 헥산을 가하여 25.0㎖로 한다.

공전 갈색유리병에 넣어 공기를 질소가스로 치환하여 밀전한 후 냉암소에 보존한다(1개월간 사용할 수 있다).

Ⓑ 토콜표준용액

토콜 약 100㎎을 정밀히 달아 헥산을 가해 녹인 후 100㎖로 한다. 이 5㎖를 취해 헥산을 가해 25.0㎖로 한다. 공전 갈색병에 넣어 공기를 질소가스로 치환하여 밀전한 후 냉암소에 보존한다(1개월간 사용할 수 있다).

㉰ 시험용액의 조제

Ⓐ 일반식품의 경우

토코페롤로서 약 0.2㎎을 함유하는 시료를 검화플라스크에 정밀히 달아(Wg) 에탄올 30㎖ 및 10% 피로갈롤‧에탄올 용액 1㎖를 가하고 이에 수산화칼륨용액(9→10) 3㎖를 가해 환류냉각기를 부착하여 비등수욕중에서 30분간 비누화한다. 비누화후 즉시 냉각하여 실온으로 한 후 물 30㎖를 가해 갈색분액여두에 옮긴다. 플라스크는 물 10㎖, 석유에테르 30㎖로 씻어 넣고 잘 흔들어 혼합하여 방치한 후 석유에테르층을 분취한다. 물층은 석유에테르 30㎖씩으로 2회 추출하고 석유에테르액을 합하여 물 10㎖로 1회, 이어 물 50㎖로 페놀프탈레인시액이 분홍색이 되지 않을 때까지 씻는다. 분액여두중에서 물을 충분히 분리한 후 무수황산나트륨을 가해 탈수한 후 석유에테르층을 갈색플라스크에 옮긴다. 잔존하는 황산나트륨은 다시 석유에테르 10㎖씩으로 2회 씻고 씻은 액을 플라스크에 모두 합한 다음 전석유에테르추출액을 40～45℃에서 감압건고한 후 잔류물은 헥산 1.0㎖를 가하여 녹여 이를 시험용액으로 한다.

Ⓑ 유지식품의 경우

검체가 유지인 경우에는 위의 조작중 비누화조작을 생략하고, 고속액체크로마토그래프에 직접 주입할 수 있다. 이 경우에는 유지 약 1g을 정밀히 달아(Wg) n-헥산으로 녹여 50㎖로 한 후, 그 중 일정량(D㎖)을 취해 헥산으로 희석한 것을 시험용액으로 한다.

㉱ 시험조작

Ⓐ 고속액체크로마토그래피 조건

- 칼럼：순상형 칼럼

- 이동상：헥산‧이소프로판올(98：2)

- 유속：0.5㎖/min

- 검출기：형광검출기(여기파장 298㎚, 측정파장 325㎚)

Ⓑ 정량시험

시험용액 1.0㎖에 토콜표준용액 1.0㎖를 가해(S) 이의 10㎕를 고속액체크로마토그래피용 칼럼에 주입하여 얻은 토코페롤동족체의 피크 넓이 또는 높이(Ptoc) 및 토콜의 피크 넓이 또는 높이(Pint)를 구한다. 또한 토코페롤동족체 각각에 대하여 각 토코페롤 표준용액 1.0㎖를 취해 이에 토콜표준용액 1.0㎖를 가해 이의 10㎕를 고속액체크로마토그래프에 주입하여 얻은 각 토코페롤 동족체의 피크 넓이 또는 높이(Pst-toc)와 토콜의 피크 넓이 또는 높이 (Pst-toc)를 구하고, 이들의 중량(㎎)에서 토코페롤 동족체의 토콜에 대한 환산계수(F)를 구한다. 검체 중 토코페롤 동족체의 함량(㎎/100g)은 다음 계산식에서 구한다.

<계  산>

㉠ 일반시료의 경우

[eqn: rm토코페롤동족체의~양(mg/100g)=S×{P_{{t}oc}}over{P_{{i}{n}{t}}}×F×{100}over{W}]

S：시험용액에 함유된 토콜의 함량(㎎)

S ＝ V × C

V：시료에 첨가한 토콜표준용액의 양(㎖)

C：시료에 첨가한 토콜표준용액의 농도(㎎/㎖)

Ptoc：시험용액중 토코페롤동족체 피크의 넓이 또는 높이

Pint：시험용액중 토콜 피크의 넓이 또는 높이

F  ：환산계수

[eqn: {{F_α-δ}}={C{st-t{o}c}}over{{C{st-{i}nt}}}}×{P{st-i{n}t}}over{{P{st-{t}oc}}}}]

Cst-toc：표준용액중 토코페롤 동족체의 농도

Pst-toc：표준용액중 토코페롤동족체 피크의 높이 또는 넓이

Cst-int：표준용액중 토콜의 농도

Pst-int：표준용액중 토콜 피크의 높이 또는 넓이

㉡ 유지식품의 경우

[eqn: rm토코페롤동족체의~양(mg/100g)=S×{50}over{D}×{P_{{t}oc}}over{P_{{i}{n}{t}}}×F×{100}over{W}]

② α, α＇-디피리딜에 의한 비색정량법

㉮ 장치

분광광도계

㉯ 시약

Ⓐ 정색용액：0.5%, α, α＇-디피리딜에탄올용액

Ⓑ 염화제이철에탄올용액：염화제이철 0.2g을 에탄올에 녹여 100㎖로 한다.

Ⓒ 석유에테르：석유에테르에 1/10량의 황산을 가하고 황산층이 착색되지 않을 때까지 세척하고 1회 수세한 다음, 순차로 10% NaOH 용액 및 물로 수세한다. 세정한 석유에테르층에 무수황산나트륨을 가하여 탈수한 다음 증류하여 30～60℃에서 유분을 취한다.

㉰ 표준용액의 조제

α-토코페롤 약 20㎎을 정밀히 달아 에탄올을 가하여 녹여 100㎖로 한다.

㉱ 시험용액의 조제

토코페롤로 0.5～1㎎에 해당하는 양의 검체를 환저플라스크에 취하고 에탄올 30㎖ 및 10% 피로가롤‧에탄올용액 1㎖를 가하고 수산화칼륨용액(9→10) 1㎖를 가하여 환류냉각기를 붙이고 수욕상에서 30분간 비누화한다. 비누화 후 신속하게 냉각하여 실온으로 하고 물 30㎖를 가하여 갈색 분액깔때기에 옮기고 플라스크는 물 10㎖, 석유에테르 30㎖로 씻고 씻은 액을 분액깔때기에 옮기고 잘 진탕 혼합하고 방치하여 석유에테르층을 분취한다. 물층은 다음에 석유에테르 30㎖씩으로 2회 추출하고 석유에테르 추출액을 합하여 물 10㎖로 1회, 50㎖씩으로(페놀프탈레인 지시약이 정색되지 않을 때까지) 세척한다. 분액깔때기중에서 물을 충분히 분리한 후, 석유에테르층에 무수황산나트륨을 가하여 탈수하고 석유에테르층은 갈색 플라스크에 옮긴다. 남은 무수황산나트륨은 석유에테르 10㎖씩으로 2회 씻고 씻은 액은 플라스크에 합한다.

석유에테르추출액을 모두 합하여 60℃에서 감압건조하고 잔류물은 에탄올 5㎖로 녹여 25㎖의 갈색플라스크에 옮긴다. 플라스크는 추가로 에탄올 5㎖씩으로 2회 씻고 씻은 액을 플라스크에 가하여 에탄올을 채워 25㎖로 하여 시험용액으로 한다.

㉲ 시험조작

시험용액 5㎖와 비타민 E 표준용액 1㎖를 25㎖의 플라스크에 취하여 각각에 염화제이철에탄올용액 1㎖와 0.5%, α, α＇-디피리딜에탄올용액 1㎖를 가하고 다음에 에탄올을 가하여 25㎖로 한다. 따로 에탄올 1㎖를 취하여 같은 방법으로 조작한 것을 대조로 하여 시험용액과 표준용액을 액층 1㎝ 파장 520㎚에서 흡광도를 측정한다.

<계  산>

[eqn: rm총토코페롤~함량(mg/100g)=C×{T}over{S}×{25}over{5}×{100}over{W}]

C：비타민 표준용액의 토코페롤 농도(㎎/㎖)

Ｔ：시험용액의 흡광도

Ｓ：표준용액의 흡광도

Ｗ：검체채취량(g)

(7) 비타민D

① 고속액체크로마토그래피에 의한 정량

㉮ 시약

Ⓐ 무알데히드에탄올：에탄올(특급) 1ℓ에 50% 수산화칼륨용액 5㎖ 및 아연분말 5g을 가하여 약 2시간 환류 후 증류한다. 단, 처음 및 마지막 증류액 각각 10%는 버린다.

Ⓑ 벤젠, 아세토니트릴 및 헥산：특급품을 증류하여 사용한다.

Ⓒ 메탄올：고속액체크로마토그래피용

㉯ 비타민D 표준용액의 조제：비타민D2 또는 D3가 1㎖중 4 IU(0.1㎍) 함유하도록 무알데히드에탄올로 녹인다.

㉰ 시험용액의 조제

검체가 고체인 경우에는 초고속마쇄기 등으로 잘게 마쇄하여 비타민D 2 IU(0.05㎍)이상 함유한 검체를 비누화 플라스크에 정밀히 취하여 피로갈롤‧에탄올(1→10)용액 40㎖를 가하여 약하게 진탕 혼합한다. 수산화칼륨(9→10) 10㎖를 가하고, 환류냉각기를 부착하여 비등수욕중에서 30분간 가열하여 비누화한다. 즉시 냉각하여 실온으로 되면 벤젠 100㎖를 가하여 15초간 강하게 진탕혼합한다. 침전이 생기면 이것이 가라앉을 때까지 방치한다. 다음에 250～300㎖ 분액여두로 옮기고, 비누화용 플라스크의 침전물은 남겨둔다(침전물을 씻어서 옮기지 말것). 분액여두에 1N 수산화칼륨 100㎖를 가하여 15초간 강하게 진탕 혼합한다. 방치하여 분리하고(벤젠층은 투명하지 않아도 된다) 혼탁한 물층을 버린다. 벤젠층에 0.5N 수산화칼륨 40㎖를 가하여 진탕혼합한 후 벤젠층을 적어도 물 40㎖씩 4회 매회 15초간 격렬하게 진탕 혼합하여 세척한다. 세척액이 페놀프탈레인시액으로 알칼리의 반응을 나타내지 않을 때까지 세척한다. 분액여두를 수분간 방치하여 최후의 물 한방울까지 분리하여 물층을 제거한다. 이 벤젠용액 80㎖를 플라스크에 취하여 40℃이하에서 용매를 감압 농축한다. 잔류물에 벤젠 5㎖를 가하여 녹이고 이 액 4.5㎖를 10㎖의 공전시험관에 취하여 같은 방법으로 감압 농축한다. 잔류물에 아세토니트릴‧메탄올(1：1) 500㎕를 정확하게 가하여 녹이고 이를 시험용액으로 한다.

㉱ 시험조작

Ⓐ 고속액체크로마토그래피 조건

㉠ 제1단계(분취용) 고속액체크로마토그래피

- 칼럼：역상형 칼럼(내경 7.5㎜, 길이 300㎜)

- 이동상：아세토니트릴：메탄올(1：1)

- 유속：2㎖/min

- 검출기：자외부(UV) 검출기(254㎚)

㉡ 제2단계(분석용) 고속액체크로마토그래피

- 칼럼：순상형 칼럼(내경 4.6㎜, 길이 250㎜)

- 이동상：0.4% 이소프로판올‧헥산용액

- 유속：1.6㎖/min

- 검출기：자외부(UV) 검출기(254㎚)

Ⓑ 정량시험

㉠ 제1단계(분취용) 고속액체크로마토그래피

시험용액 200㎕를 정확히 취해 제1단계 고속액체크로마토그래피에 주입하여 분획포집기로 비타민D 획분을 분취한다(비타민D 표준용액의 크로마토그램으로 비타민D가 검출기에 도달하는 시간을 측정하여 피크가 검출기에 도달하는 전후 30초 동안 분액을 받을 수 있도록 예비실험으로 분석조건을 준비한다).

㉡ 제2단계(분석용) 고속액체크로마토그래피

제1단계에서 얻은 비타민D 분획의 용매를 감압농축하여 잔류물에 0.4% 이소프로판올‧헥산 200㎕를 정확히 가하여 녹인다. 이 용액 100㎕를 정확히 취하여 제2단계 고속액체크로마토그래피에 주입하여 얻어진 크로마토그램에 나타난 비타민D의 피크의 높이 또는 면적을 측정한다.

㉢ 비타민D 표준용액에 대한 조작

별도로 비타민D 표준용액 1㎖에 대하여 상기의 시험용액의 조제 및 시험조작 제1단계, 제2단계의 조작에 따라 실행한 후 비타민D의 피크의 높이 또는 면적을 측정한다.

[계산식]

[eqn: rm검체100g중의 ~비타민D(IU)={P_st}over{P_sa}×{S}over{검체채취량(g)}×100]

S : 비타민D 표준용액의 농도(IU/㎖)

Pst: 비타민D 표준용액의 피크의 높이 또는 면적

Psa: 검체에 대한 피크의 높이 또는 면적

(8) 비타민K1

① 고속액체크로마토그래피에 의한 정량

㉮ 시약

Ⓐ 용매：메탄올, 디클로로메탄, 이소옥탄, 아세톤 및 이소프로판올(고속액체크로마토그래피용)

Ⓑ Conditioning용액：이소프로판올을 이소옥탄에 녹여 0.01%가 되게 한다.

Ⓒ 용출용매(이동상)：디클로로메탄과 이소프로판올을 이소옥탄에 녹여 각각 15%, 0.02%가 되게 한다.

Ⓓ 암모니아수(36%)

Ⓔ 무수황산나트륨

㉯ 표준용액의 조제

비타민K1 표준품은 trans와 cis 이성체를 함유하므로 각각의 이성체들을 분리하여 전체에 대한 cis형과 trans형의 피크 면적 비를 구한다(불활성형 cis형을 ≤20%정도 함유함). 암소에서 보관한다.

Ⓐ 표준원액：비타민K1 표준품을 이소옥탄에 녹여 5㎍/㎖가 되게 한다.

Ⓑ 표준용액：표준원액을 이소옥탄으로 희석하여 0.7㎍/㎖가 되게 한다.

㉰ 시험용액의 조제

Ⓐ 검체의 비누화와 추출

검체 일정량(비타민K1으로서 3.5㎍함유)을 정확히 취하여 500㎖ 분액여두에 넣고 암모니아수 4㎖를 가한 후 60초간 흔들어 혼합한다.

여기에 60㎖의 메탄올을 가하고 30초간 혼합한 후 디클로로메탄 100㎖와 이소옥탄 50㎖ 혼합액을 가하여 잘 흔들어 추출한다. 층 분리 후 하층액을 1,000㎖ 공전플라스크에 옮긴다. 다시 디클로로메탄 100㎖와 이소옥탄 50㎖ 혼합액을 가하여 추출한 후 하층액을 합하고 이 액을 75℃ 이하에서 감압 농축한다. 공전플라스크를 아세톤 20㎖로 씻고 그 액을 농축시키는 조작을 3회 반복한 후 질소 충전하여 차광한 채로 밀봉한다.

Ⓑ 시험용액의 정제

정제 칼럼에 conditioning 용액 20㎖를 주입하고 천천히 용출시켜 그 액을 버린다. 잔류물을 conditioning 용액 10㎖로 녹인 후 칼럼에 통과시켜 비타민K1을 흡착시킨다. 같은 용액으로 5㎖씩 2회에 걸쳐 공전플라스크를 씻고, 씻은 액을 칼럼에 넣은 후 conditioning 용액으로 용출하여 그 액을 버린다.

이어 검체의 지방 함량에 따라 양을 달리하여 용출용매를 칼럼에 통과시킨다(검체의 지방함량이 0.72～0.80g이면 100㎖의 용매를, 0.72g 이하이면 예비실험을 통해 용출액의 양을 결정한다). 용출액을 250㎖ 공전플라스크에 받아 75℃ 이하에서 감압 농축한다. 이 농축액을 이소옥탄 1～2㎖로 몇 회 나누어 씻어 5㎖로 정용한다.

- 정제칼럼：60～200 메쉬 실리카 5.0g(100℃ 오븐에서 하룻밤 동안 활성화시킴)을 정제 칼럼(1.0㎝ id×30㎝, 유리 칼럼)에 충전하고 그 위에 무수황산나트륨 2.0g(100℃ 오븐에서 하룻밤 동안 활성화시킴)을 가한다.

㉱ 시험조작

Ⓐ 고속액체크로마토그래피 조건

- 칼럼：5㎛실리카가 충전된 250×4.6㎜ id의 순상형 칼럼

- 이동상：디클로로메탄과 이소프로판올을 이소옥탄에 녹여 각각 30%, 0.02%가 되게 한다.

- 검출기：자외부(UV) 검출기(254㎚)

Ⓑ 정량시험

시험용액 및 표준용액을 각각 20㎕씩 주입하여 얻은 표준용액의 피크면적 또는 높이에 대해 구한 검량선을 사용하여 검체 중 비타민K1(C)의 함량을 구한다. 비타민K1의 함량은 각 이성체의 농도의 합으로 계산하며 옥수수유를 포함하는 조제유류는 trans-비타민K1만을 계산한다.

[계산식]

C(μg/100g)＝Cstd × F ×[eqn: rm {H_s } over {H_std} TIMES {V} over {S} TIMES 100]

Cstd：표준용액의 농도(㎍/㎖)

F  ：비타민K1 표준용액에서 각각의 이성체의 비율

Hs ：검체의 비타민K1 각각의 이성체의 피크 면적 또는 높이

Hstd：비타민K1 표준용액 각각의 이성체의 피크 면적 또는 높이

V  ：희석배수

S   ：검체 채취량(g)

(9) 비타민 B6(피리독신 염산염)

① 고속액체크로마토그래피에 의한 정량

㉮ 시약

50mM NaH2PO4 : NaH2PO4 6.0g을 증류수에 녹이고 염산으로 pH 2.5로 조절한 후 전량을 1ℓ로 한다.

㉯ 표준용액의 조제

비타민 B6(피리독신염산염)을 증류수에 녹여 표준원액(100㎍/㎖)을 조제하고, 표준원액을 증류수로 적당히 희석하여 표준용액을 만든다.

㉰ 시험용액의 조제

검체 적당량을 취하여 잘게 부순 후, 증류수 25㎖를 가하여 30분 동안 초음파로 추출하고, 3,000rpm에서 원심분리하여 상등액을 여과한다. 잔류물에 증류수 25㎖를 다시 가하여 30분 동안 초음파로 추출하고, 원심분리하여 상등액을 여과하여 앞의 여액과 합하여 50㎖로 맞춘다. 이액을 0.45㎛ 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

㉱ 시험조작

Ⓐ 고속액체크로마토그래피의 조건

- 칼럼 : 역상분배형( C18 또는 이와 동등한 것)

- 이동상 : 50mM NaH2PO4(pH 2.5)

- 유속 : 1.0㎖/min

- 검출기 : 형광검출기(여기파장 : 290㎚, 측정파장 : 396㎚)

Ⓑ 정량시험

시험용액 및 표준용액을 각각 10㎕씩 주입하여 앞의 조건에서 시험한다. 표준용액의 피크의 넓이 또는 높이에 의해 구한 검량선을 사용하여  시험용액의 비타민 B6(피리독신)의 농도(㎍/㎖)를 구하고, 다음의 식에 의하여 검체 중 비타민 B6의 함량(㎎/100g)을 구한다.

[계산식]

[eqn: rm 비타민{B_6}(피리독신, mg/100g)=S×{a×b}over{검체량(g)}×{100}over{1,000}]

S : 시험용액중의 비타민B6(피리독신)의 농도(㎍/㎖)

a : 시험용액의 전량(㎖)

b : 시험용액의 희석배수

(10) 비타민의 미생물학적 분석법

① 일반정량조작법

㉮ 장치 및 기구

Ⓐ 항온기

Ⓑ 건조기

Ⓒ 멸균기

Ⓓ 무균대

Ⓔ 시험관, 피펫 등：시험균의 증식은 유리기구에 부착된 미량의 비타민 또는 세정제에 의하여 쉽게 영향을 받기 때문에 유리기구는 적당한 계면활성제 등으로 하루 처리한 후 충분히 물로 닦아둔다.

㉯ 시약

사용 시약류는 가능한 한 순수한 시판품을 이용하고 검량선 작성을 위한 표준품은 표준비타민을 이용한다.

㉰ 시험균의 보존

유산균류는 고층한천배지에, 효모류는 사면한천배지에 보존하며, 유산균과 효모용 보존배지의 조성은 다음과 같다. 유산균은 효모엑기스 분말 1%, 펩톤 0.5%, 포도당 1%, 초산나트륨 1%, KH2PO4 0.2%, 한천 1.5%의 조성으로 하고, 효모용은 맥아엑기스분말 3%, 한천 1.5%로 한다. 한천을 가하기 전에 각 성분을 잘 녹이고 pH를 6.8～7.0으로 조정하여 여과한 후, 한천을 가하여 가온 상태에서 10㎖씩 시험관에 분주하여 멸균한다. 균은 접종하여 유산균은 37℃, 효모는 30℃에서 약 20시간 배양한다. 배양 후 5℃에 보존하면서 1～3주 간격으로 새로 배양한다. 사용하지 않을 때에는 동결건조법에 의해 보존한다.

㉱ 접종균액

유산균 접종배지는 효모엑기스분말 1%, 펩톤 0.5%, 포도당 1%, 초산나트륨 1%, 염류용액 A와 B는 기초배지의 1/2 양으로 사용한다. 이 액체배지에 보존균을 접종한다. 필요하면 16～24시간 정도 같은 배지에 2～3회 배양한다. 증식된 균체는 3,000rpm에서 원심분리하여 0.9% NaCl용액으로 3회 세정한 후, 적당한 농도의 균액(배지의 5～100배 용량의 0.9% NaCl용액을 가한다)이 될 때까지 희석하여 접종균액으로 한다. 이 균액을 접종하는 모든 실험 조작은 무균적으로 행해야 한다.

㉲ 정량용 기초배지

Ⓐ 염류용액 A

KH2PO4와 K2HPO4 각 5g을 물에 녹여 전량을 100㎖로 하여 HCl 1방울 및 톨루엔 소량을 가해서 보존한다.

Ⓑ 염류용액 B

MgSO4‧7H2O 2g, NaCl 0.1g, FeSO4‧7H2O 0.1g 및 MnSO4‧4H2O 0.1g을 물에 녹여 전량을 100㎖로 하여 HCl 1방울 및 톨루엔 소량을 가해서 보존한다.

Ⓒ 카제인 산분해용액

비타민이 포함되어 있지 않은 카제인 100g을 95% 알코올로 2회 세정하여, 5배 양의 20% HCl을 가해서 8～12시간 동안 가열 환류하거나 또는 멸균기에서 121℃로 8～12시간 가열한다. 계속해서 점액의 형태가 될 때까지 감압하여 HCl을 제거하고, 여기에 물 200㎖를 가해 감압하에서 HCl을 제거한다. 잔류물을 물에 녹이고 10% NaOH를 가하여 pH를 3.5±0.1로 조정하고 여기에 물을 가하여 1ℓ로 만든다. 계속해서 활성탄 20g을 가해 1시간 정도 혼합한 후 여과한다. 여액이 담황색 또는 무색이 될 때까지 이 조작을 되풀이한 후, 소량의 톨루엔을 가하여 냉암소에 보관한다. 보관 중 침전이 생기면 여과해서 사용한다.

㉳ 시험조작

특별한 기준이 없을 경우, 배양액은 5㎖ 또는 10㎖로 한다. 정량하고자 하는 비타민의 표준계열은 동질, 동형의 시험관을 사용하고, 각 농도에 관해서 2～3개씩 4～8단계로 하며, 비타민표준용액을 포함하지 않는 시험관을 공시험용으로 하여 4～6개 준비한다. 총량이 5㎖일 경우 기초배지는 2.5㎖를 사용하고, 10㎖일 경우 기초배지는 5㎖를 가한 후, 물을 가해서 각각 5㎖ 또는 10㎖로 만든다. 시험용액의 계열은 각 시험법에 규정된 방법으로 제조한 시험용액에 관해서 각 농도별로 시험관을 각각 2～3개씩 보통 4단계로 하고 표준계열과 같은 방법으로 동량의 기초배지를 가한 후 물을 가해서 표준계열과 동량으로 한다. 분주가 끝나면 면전하여 121℃의 조건에서 5분간 가압 살균한다. 표준용액을 포함하지 않은 시험관은 1조(2～3개)를 제거하고, 각 시험관에 접종액 1방울씩을 무균적으로 가한 후, 30～37℃에서 16～24시간 배양 후 탁도법에 의하여 증식도를 측정한다. 증식도를 탁도법으로 측정할 때는 각 시험관의 내용물을 10㎜ 직경의 흡수 cell에 옮기고 비타민 표준용액을 포함하지 않고 또한 균액을 접종하지 않는 시험관의 투과도를 100%로 하여, 분광광도기에서 540～610㎚의 파장으로 투과도 또는 흡광도를 구한다. 잡균이 혼입된 것이 밝혀진 경우나 기초배지 또는 접종균액 중에 정량하고자 하는 비타민이 혼재해서 표준용액을 넣지 않은 대조 시험관에서의 증식이 느린 경우(투과율 90% 이하) 및 표준계열에 의한 최고의 증식이 소정의 증식도에 달하지 않을 때(투과율 40% 이상)는 다시 시험한다.

㉴ 탁도법에 의한 계산

검량선을 작성할 때는 횡축에는 표준용액의 농도 또는 ㎖수의 대수를, 종축에는 투과도 또는 흡광도를 취한다. 표준용액의 각 농도단계에 관해서 얻어진 투과도 또는 흡광도의 평균치를 구해, 그 값(y)을 정점으로 해서 직선을 그린다. 계속해서 시험용액의 각 농도단계에 관해서 투과도 또는 흡광도를 구해, 횡축에 시료의 g수 또는 시료용액 ㎖수의 대수를 임의로 취하여 실험치 y를 정점으로 하여 직선을 그린다.

이때 적어도 3점 이상이 직선을 구성하여야 한다. 표준용액 및 시험용액은 직선으로 평행하는 부분에 관해서 시험용액 1㎖ 또는 시료 1g당의 함유량을 구해 다음의 계산법에 따라 시료중의 비타민 함량을 산출한다.

[계산식]

[eqn: rm 비타민함량=시험용액의~비타민함량×{희석농도}over{시료량}]

② 비타민B6

㉮ 시약

Ⓐ 비타민B6 보존용액

H2SO4를 넣은 감압 데시케이터에서 24시간 건조된 비타민B6 표준품 50㎎을 정밀하게 취하여, 500㎖의 메스플라스크에 넣고 1N HCl을 가하여 전량을 500㎖로 만든 후 갈색병에 넣어 냉소에 보관한다. 이 용액 1㎖는 피리독신염산염 100㎍을 포함한다.

Ⓑ 비타민B6 표준용액

비타민B6 보존용액을 물로 희석해서 1㎖에 피리독신염산염 5㎍을 포함하도록 한다. 사용 시 조제한다.

Ⓒ 카제인 산분해용액

① 일반정량조작법 ㉲ 정량용 기초배지에 따른다.

Ⓓ 비타민B1용액

비타민B1염산염 10㎎을 물에 용해해서 1,000㎖로 만든다. 이 용액 1㎖는 비타민B1염산염 10㎍을 포함한다.

Ⓔ 이노시톨용액

이노시톨 100㎎을 물에 용해해서 100㎖로 만든다. 이 용액 1㎖는 이노시톨 1㎎을 포함한다.

Ⓕ 비오틴용액

비오틴 25㎎을 물에 용해해서 1,000㎖로 만든 후 이중 40㎖를 취해 물을 가하여 1,000㎖로 만든다. 이 용액 1㎖는 비오틴 1㎍을 포함한다.

Ⓖ 판토텐산칼륨용액

판토텐산칼륨 20㎎을 물에 용해해서 100㎖로 만든다. 이 용액 1㎖는 판토텐산칼륨 0.2㎎을 포함한다.

Ⓗ 니코틴산용액

니코틴산 100㎎을 물에 용해해서 100㎖로 만든다. 이 용액 1㎖는 니코틴산 1㎎을 포함한다.

Ⓘ 염류용액

KH2PO4 2.2g, KCl 1.7g, CaCl2‧2H2O 0.5g, MgSO4‧7H2O 0.5g, MnSO4‧4H2O 0.01g 및 FeCl3 0.01g을 물에 용해해서 전량을 100㎖로 만든다. 불용물질이 있으면 여과한다.

Ⓙ 구연산완충액

구연산칼륨 10g과 구연산 2g을 물에 녹여 전량을 100㎖로 만든다.

㉯ 기초배지의 조제

카제인 산분해용액 10㎖, 비타민B1용액 5㎖, 이노시톨용액 5㎖, 비오틴용액 2㎖, 판토텐산칼륨용액 2.5㎖, 니코틴산용액 0.5㎖, 염류용액 50㎖ 및 구연산완충액 10㎖를 혼합하고 여기에 포도당 10g을 가하여 녹인다. 10% NaCl 용액으로 pH를 5.0～5.2로 조정한 후 물을 가하여 전량을 100㎖로 만든다. 용해되지 않은 물질이 있으면 여과한다. Pyridoxine assay medium(Difco)을 사용할 수 있다.

㉰ 접종균액의 조제

Ⓐ Saccharomyces pastorianus의 보존균주

Saccharomyces pastorianus ATCC 9080을 효모용 한천사면배지 또는 Wort agar(Difco)에 접종하여, 30℃에서 16～24시간 배양 후 냉소에 보관한다. 보관균주는 2주 간격으로 새로 배양한다.

Ⓑ 배지

기초배지 100㎖에 피리독신염산염 1μg을 포함한 물 100㎖를 가하여 접종균액 조제용 배지로 한다. 이 배지를 소시험관에 2㎖씩 분주하여 면전한 후 121℃에서 10분간 가압 멸균하여 방냉한다.

Ⓒ 접종용액

Saccharomyces pastorianus의 보존균주를 멸균된 배지에 접종하여 30℃에서 16～24시간 배양한다. 배양균을 원심분리하여 취한 후 이를 0.9% NaCl용액으로 2회 세척하고, 0.9% NaCl용액을 이용해서 약 20배로 희석하여 접종용액으로 한다.

㉱ 시험용액의 조제

시료 2g을 500㎖의 삼각플라스크에 취하여, 10N HCl 1㎖ 및 물 180㎖를 가하여 뚜껑을 하고 121℃에서 4시간 가압 추출한다. 식힌 후 10% NaOH용액으로 pH를 4.5로 조정하고, 여기에 물을 가하여 전량을 200㎖로 만든다. 필요시 여과한다. 시험용액 1㎖가 비타민B6 약 5㎍을 포함하도록 여액을 물로 적당히 희석하여 시험용액으로 한다.

㉲ 시험조작

비타민B6 표준용액의 계열을 만들기 위해서, 2개씩의 시험관에 비타민B6 표준용액 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 3.0 및 4.0㎖를 각각 취하고, 각 시험관에 기초배지 5㎖ 및 물을 가해서 전량을 10㎖로 만든다. 특히 시험용액의 계열을 만들기 위해서 2개씩의 시험관에 시험용액 1.0, 1.5, 2.0 및 3.0㎖를 가하고 각 시험관에 기초배지 5㎖ 및 물을 가해서 전량을 10㎖로 만든다. 시험관의 내용물을 잘 혼합해서 면전한 후 100℃에서 10분간 멸균하여 식히고, 각 관에 접종용액 한방울씩을 무균적으로 접종하여 30℃에서 16～24시간 배양한다. 배양후 균의 증식을 정지시키기 위하여 100℃에서 5분간 멸균한 후 탁도법에 의하여 균의 증식을 측정한다.

③ 엽산

㉮ 시약

Ⓐ 엽산 보존용액

P2O5를 넣은 데시케이터에서 건조시킨 엽산 표준품 50㎎을 정확하게 취하여 500㎖의 메스플라스크에 넣어 0.01N NaOH용액 약 30㎖로 녹이고, 물 약 300㎖를 가한 후 HCl로 pH를 7～8로 조정하고 물을 가하여 500㎖로 만든다. 톨루엔을 가하여 약 10℃로 보존한다. 이 용액 1㎖는 엽산 100㎍을 포함한다.

Ⓑ 엽산 표준용액

엽산 보존용액을 물로 희석해서 1㎖에 엽산 2㎍을 포함하도록 한다. 사용 시 조제한다.

Ⓒ 시스틴 트립토판 용액

L-시스틴 2g 및 L-트립토판 0.5g(또는 DL-트립토판 1g)을 350～400㎖의 물로 희석하여 70～80℃로 가열하고, 고형물이 녹을 때까지 20% HCl을 첨가한다. 식힌 후 물을 가해서 전량을 500㎖로 만들고, 톨루엔 소량을 가하여 10℃에 보관한다.

Ⓓ 아데닌-구아닌-우라실용액

아데닌황산염, 구아닌염산염 및 우라실 각 0.1g을 20% HCl 5㎖로 가열하면서 녹이고 식힌 후 물을 가하여 100㎖로 만든다. 톨루엔 소량을 가하여 10℃에 보관한다.

Ⓔ 카제인 산분해용액

① 일반정량조작법 ㉲ 정량용 기초배지에 따른다.

Ⓕ 염류용액 B

① 일반정량조작법 ㉲ 정량용 기초배지에 따른다.

Ⓖ 크산틴 용액

물 약 80㎖에 크산틴 0.4g을 가하여 70℃로 가열하면서 10% 암모니아수 12㎖를 가하여 크산틴이 녹을 때까지 젓는다. 식힌 후 물을 가하여 400㎖로 만든다. 톨루엔을 가하여 보존한다.

Ⓗ 비타민 용액

파라아미노안식향산 10㎎, 피리독신염산염 40㎎, 비타민B1염산염 4㎎, 판토텐산 칼륨 8㎎, 니코틴산 8㎎ 및 비오틴 0.2㎎을 약 300㎖의 물로 녹이고, 여기에 비타민B12 10㎎을 0.02N 초산으로 녹인 용액 200㎖를 가한다. 계속해서 무수초산나트륨 1.9g과 초산 1.6㎖를 40㎖의 물로 녹인 용액을 가한 후, 물을 가해서 2ℓ로 만든다. 톨루엔을 가하여 보존한다.

Ⓘ 아스파라긴 용액

L-아스파라긴 8g을 물에 용해해서 800㎖로 만든다. 톨루엔을 가하여 보존한다.

Ⓙ MnSO4 용액

MnSO4‧4H2O 2g을 물에 용해해서 200㎖로 만든다. 톨루엔을 가하여 보존한다.

Ⓚ 폴리솔베이트 80 용액

폴리솔베이트 80(Polyoxyethylene sorbitan monooleate) 25g을 에탄올로 녹여 250㎖로 만든다.

㉯ 기초배지의 조제

카제인 산분해용액 10㎖, 시스틴-트립토판용액 20㎖, 아스파라긴용액 3㎖, 아데닌-구아닌-우라실용액 1㎖, 크산틴용액 2㎖, 비타민용액 20㎖, 염류용액B 2㎖, MnSO4 용액 2㎖ 및 폴리솔베이트80용액 0.1㎖를 잘 섞고, 여기에 포도당 4g, 인산이칼륨(K2HPO4) 0.64g 및 구연산나트륨(C6H5O7Na3‧2H2O) 5.2g을 가하여 녹이고, 10% NaOH용액으로 pH를 6.8로 조정한 후, 물을 가하여 100㎖로 만든다. 불용물질이 있으면 여과한다.

Folic acid assay medium(Difco)을 사용할 수 있다.

㉰ 접종균액의 조제

Ⓐ Streptococcus faecalis의 보존균주

물 100㎖에 효모엑기스 2g을 녹이고 여기에 포도당 0.5g, 무수초산나트륨 0.5g을 가하여 pH를 6.8로 조정한다.

수욕상에서 10～20분간 가열하여 여과한 후 한천 1.5g을 가하여 한천이 용해될 때까지 수욕상에서 세게 혼합하면서 가열한다. 뜨거운 상태에서 10㎖씩을 시험관에 분주하여 면전하고 121℃에서 10분간 가압멸균한 후 시험관을 수직으로 세워 식힌다.

Streptococcus faecalis ATCC 8043의 보존균주를 멸균된 배지 10㎖에 접종하여 37℃에서 16～24시간 배양하여 냉소에 보관한다. 보존균주는 매주 새로 배양하고 1주를 넘은 것은 사용하지 않는다.

Ⓑ 배지

한천을 제외한 보존배지로 조제한 액체배지 2㎖를 소시험관에 분주하여 면전한 후, 121℃에서 10분간 가압 멸균하여 방냉한다.

Ⓒ 접종균액

Streptococcus faecalis의 보존균주로부터 멸균된 배지에 접종하여, 37℃에서 16～24시간 배양 후 증식된 균체를 무균적으로 원심분리하고, 0.9% NaCl 용액으로 2회 세척한 후, 0.9% NaCl용액 약 2㎖를 가해서 접종균액으로 한다.

㉱ 시험용액의 조제

일정량의 시료를 플라스크에 넣고, 여기에 적어도 시료의 10배량의 물을 가한다. 이 때 이 액 1㎖는 엽산 1㎎ 이상을 포함하여야 한다. 여기에 약 10% 암모니아수를 100㎖당 2㎖의 비로 가해서 잘 섞고, 가압멸균기에 넣어 121℃에서 약 15분간 가열한 후 식혀, 물을 가해 일정량으로 하여 여과 또는 원심분리하여 투명한 용액으로 만든다. 다음에 pH를 6.8로 조정한 후, 물을 가하여 적당히 희석한 것을 시험용액으로 한다. 시험용액 1㎖는 엽산 약 2㎍을 포함하도록 조제한다.

㉲ 시험조작

엽산표준용액의 계열을 만들기 위해서 시험관 2개씩에 엽산표준용액 0, 0.25, 0.5, 0.75, 1.0, 1.5, 1.75 및 2.0㎖를 취하여 각 시험관에 기초배지 2㎖ 및 물을 가해서 각각 4㎖로 만든다. 시험용액의 계열은 시험관 3개씩에 시험용액 0.5, 1.0 및 1.5㎖를 가하고 각 시험관에 기초배지 2㎖ 및 물을 가하여 4㎖로 만든다. 시험관의 내용물을 잘 섞어 면전하고 121℃에서 5분간 가압 멸균하여 식힌 후 각 시험관에 접종균액 1방울씩을 무균적으로 접종하여 37℃에서 20～24시간 배양한다. 탁도법에 의하여 균의 증식도를 측정한다.

④ 판토텐산

㉮ 시약

Ⓐ 판토텐산칼륨 보존용액

P2O5를 넣은 데시케이터중에서 건조시킨 판토텐산칼륨 표준품 50㎎을 정확하게 취하여, 1l의 메스플라스크에 넣고 약 500㎖의 물을 가하여 용해한다. 여기에 0.2N 초산 10㎖, 2% 초산나트륨 100㎖ 및 물을 가해서 1,000㎖로 만든다. 톨루엔을 소량 가하여 냉소에 보관한다. 판토텐산칼륨 보존용액 1㎖에는 판토텐산칼륨 50㎍을 포함한다.

Ⓑ 판토텐산칼륨 표준용액

판토텐산칼륨 보존용액을 희석하여 1㎖당 판토텐산칼륨 0.5㎍을 포함하도록 한다. 사용 시 조제한다.

Ⓒ 카제인 산분해용액

① 일반정량조작법 ㉲ 정량용 기초배지에 따른다.

Ⓓ 시스틴-트립토판 용액

L-시스틴 2g 및 L-트립토판 0.5g을 350～400㎖의 물로 녹이고 70～80℃로 가열하여 고형물이 완전히 녹을 때까지 20% HCl을 떨어뜨린다. 식힌 후 물을 가해서 전량을 500㎖로 만들고 톨루엔 소량을 가하여 약 10℃에서 보존한다.

Ⓔ 아데닌-구아닌-우라실용액

아데닌황산염, 구아닌염산염 및 우라실 각 0.1g을 20% HCl 5㎖로 가열하면서 녹이고 식힌 후 물을 가하여 100㎖로 만든다. 톨루엔 소량을 가해서 약 10℃로 보존한다.

Ⓕ 비타민B1-비타민B2-비오틴용액

비타민B1염산염, 비타민B2 및 비오틴을 0.02N 초산에 용해하여, 그 1㎖에 비타민B1염산염 10㎍, 비타민B2 20㎍ 및 비오틴 0.04㎍을 포함하도록 한다. 톨루엔을 소량 가하여 빛을 차단하고 냉소에 보관한다.

Ⓖ 염류용액A

① 일반정량조작법 ㉲ 정량용 기초배지에 따른다.

Ⓗ 염류용액B

① 일반정량조작법 ㉲ 정량용 기초배지에 따른다.

Ⓘ 파라아미노안식향산-니코틴산-비타민B6용액

보존용액 1㎖에 파라아미노안식향산 10㎍, 니코틴산 20㎍ 및 피리독신염산염 40㎍을 포함하도록 25% 에탄올로 용해하여 냉소에 보관한다.

㉯ 기초배지의 조제

카제인 산분해용액 10㎖, 시스틴-트립토판용액 10㎖, 아데닌-구아닌-우라실용액 2㎖, 비타민B1-비타민B2-비오틴용액 2㎖, 파라아미노안식향산-니코틴산-비타민B6용액 2㎖, 염류용액A 2㎖ 및 염류용액B 2㎖를 혼합하여 여기에 포도당 4g 및 무수초산나트륨 2g을 가해서 녹이고, 10% NaOH용액으로 pH를 6.8로 조정한 후 물을 가해서 전량을 100㎖로 만든다. 불용물질이 있으면 여과한다. Pantothenate medium(Difco)을 사용할 수 있다.

㉰ 접종균액의 조제

Ⓐ Lactobacillus plantarum의 보존균주

물 100㎖에 효모엑기스 2g을 녹이고, 여기에 포도당 0.5g, 무수초산나트륨 0.5g을 가해 pH를 6.8로 조정한 후 수욕상에서 10～20분간 가열하여 여과한다. 한천 1.5g을 가해 한천이 녹을 때까지 수욕상에서 세게 진탕하면서 가열한다. 뜨거운 상태에서 10㎖씩 시험관에 분주하여 면전하고, 121℃에서 10분간 가압멸균한 후 시험관을 똑바로 놓고 식힌다. Lactobacillus plantarum ATCC 8014의 보존균주로부터 멸균된 배지에 접종한 후 37℃에 16～24시간 배양하여 냉소에 보관한다. 보존균주는 매주 새로 조제하고 1주가 넘은 것은 사용하지 않는다.

Ⓑ 배지

기초배지 5㎖를 넣은 시험관에 판토텐산칼륨 0.2㎍을 포함한 물 5㎖를 가하고 면전을 하여, 121℃에서 10분간 가압멸균한 후 식힌다. Bacto micro inoculum broth(Difco)를 사용할 수 있다.

Ⓒ 접종균액

Lactobacillus plantarum의 보존균주를 멸균된 배지 10㎖에 접종하여 37℃에서 16～24시간 배양한다. 배양액을 잘 진탕혼합한 후 그대로 접종균액으로 사용한다.

㉱ 시험용액의 조제

시료에 10배 용량의 물을 가하여 잘 섞으면서 초산 및 초산나트륨 용액으로 pH를   5.6～5.7로 조정한다. 이를 가압멸균기에 넣고, 121℃에서 약 5분간 가열한 후 식힌다. 필요하면 10% HCl을 가해 pH를 4.0～4.5로 조정하여 단백질 등을 침전, 제거시키고 투명한 액으로 만든다. 다음에 NaOH용액을 가해서 pH를 6.8로 조정하고 물을 가하여 용액 1㎖에 판토텐산 약 0.05㎍을 포함하도록 희석한다.

㉲ 시험조작

판토텐산칼륨 표준용액의 계열을 만들기 위해서, 시험관 2개씩에 판토텐산칼륨 표준용액을 각각 0, 0.25, 0.5, 0.75, 1.0, 1.25, 1.5, 1.75 및 2.0㎖를 취하고, 각 시험관에 기초배지 2㎖ 및 물을 가해서 전량을 4㎖로 만든다. 시험용액을 만들기 위해서는 시험용액을 각각 0.5, 1.0 및 1.5㎖를 취하고 각 시험관에 기초배지 2㎖ 및 물을 가하여 전량을 4㎖로 만든다. 시험관의 내용물을 잘 혼합한 후 면전하여 121℃에서 5분간 가압멸균하고 식힌 후 각 시험관에 접종균액 1방울씩을 무균적으로 접종하여, 37℃에서 20～24시간 배양한다. 배양후 각 시험관의 내용물을 잘 진탕 혼합하여 균일한 부유액으로 만든 후 540～660㎚의 파장에서 흡광도를 측정한다.

판토텐산칼륨 표준계열에 의한 흡광도의 평균치로부터 검량선을 작성한다. 이 검량선을 이용하여 시료계열의 각 시험관의 판토텐산칼륨 함량을 구한다. 이 때 값이 0.09㎍이상 또는 0.01㎍이하의 것이 있으면 제외하고, 남은 각 관에 대하여 시험용액 1㎖에 대한 판토텐산칼륨의 함량을 계산한다. 6개 이상의 시험관으로부터 얻어진 각각의 값이 그들의 평균치보다 10%이상 벗어나지 않는 것을 확인한 다음에 이 값만의 평균치를 구하여 시료중의 판토텐산칼륨의 함량을 산출한다. 그 다음에 여기에서 얻은 값으로 환산계수 0.916을 곱해서 판토텐산 함량을 구한다.

⑤ 비타민B12

㉮ 시약

Ⓐ 시아노코발아민 보존용액

데시케이터중에서 건조시킨 시아노코발아민 표준품을 시아노코발아민의 양이 50～60㎍에 해당되도록 정확히 칭량하여 25% 알코올을 가한 후 ㎖당 100ng의 농도가 되도록 표준용액 농축액을 만든다. 농축액은 10℃에 보관한다.

Ⓑ 시아노코발아민 표준용액

이 용액에 일정량의 증류수를 가하여 500㎖로 희석한다. 이 표준용액의 농도는 ㎖당 0.01～0.04ng에 해당하는 농도로서, 시료의 농도와 유사하도록 한다. 같은 방법으로 시료중의 비타민B12 농도보다 높은 농도 및 낮은 농도(예：0.010ng/㎖와 0.020ng/㎖)의 표준용액을 준비한다.

Ⓒ 아데닌-구아닌-우라실 용액

아데닌황산염, 구아닌염산염, 우라실 1.0g을 50㎖의 가온한 HCl로 용해하고(1＋1) 물을 가하여 1ℓ로 만든다.

Ⓓ 아스파라긴 용액

L-아스파라긴 10g을 물로 녹이고 1ℓ로 만든다.

Ⓔ 폴리솔베이트80용액

폴리솔베이트80 25g을 알코올로 녹여 250㎖로 만든다.

Ⓕ 염류용액A

① 일반정량조작법 ㉲ 정량용 기초배지에 따른다.

Ⓖ 염류용액B

① 일반정량조작법 ㉲ 정량용 기초배지에 따른다.

Ⓗ 비타민용액 Ⅰ

비타민B2 25㎎, 비타민B1염산염 25㎎, 비오틴 0.25㎎, 나이아신 50㎎을 0.02N 초산으로 녹이고 1ℓ로 만든다.

Ⓘ 비타민용액 Ⅱ

파라아미노벤조산(PABA) 50㎎, 판토텐산 25㎎, 피리독신염산염 100㎎, 피리독살염산염 100㎎, 피리독사민염산염 20㎎, 엽산 5㎎을 25% 알코올로 녹이고 1ℓ로 만든다.

Ⓙ 부유배지(Suspension medium)

기초배지 5㎖를 동량의 물로 희석하여 시험관에 넣고 면전하여 121℃에서 15분간 멸균한 후 빨리 식힌다. 10℃의 암소에 저장한다.

Ⓚ 크산틴용액

크산틴 1.0g을 150～200㎖의 물로 녹이고 약 70℃로 가열하면서, 30㎖의 NH4OH(2＋3)를 넣고 완전히 녹을 때까지 저은 후 물을 가하여 1ℓ로 만든다.

Ⓛ 카제인 산분해용액

① 일반정량조작법 ㉲ 정량용 기초배지에 따른다.

㉯ 기초배지

비타민B12가 포함되어 있지 않은 2배농도의 기초배지 1ℓ를 준비하기 위하여 다음의 물질들을 순서대로 첨가한다. 아데닌-구아닌-우라실용액 20㎖, 아스파라긴용액 20㎖, 염류용액A 20㎖, 염류용액B 20㎖, 비타민용액Ⅰ40㎖, 비타민용액Ⅱ 40㎖, 크산틴용액 20㎖, 폴리솔베이트80 용액 20㎖를 넣은 후 증류수를 가하여 약 800㎖로 만든다. 계속해서 다음 물질들을 순서대로 가한다. 산가수분해카제인 10g, L-시스틴 0.4g, DL-트립토판 0.4g을 최소량의 묽은 염산(236㎖ 진한염산/ℓ)으로 녹인 용액과 포도당 40g, sodium acetate trihydrate 33.2g, 아스코르빈산 4g을 넣는다. 아스코르빈산을 가한 후에는 강하게 교반하지 않아야 한다. 모든 고형분이 완전히 녹을 때까지 가볍게 젓는다. HCl 또는 NaOH를 사용하여 pH를 6.0으로 조정한다. 지시약을 사용할 때는 지시약이 폴리솔베이트를 흡수하기 때문에 pH를 조정한 후 폴리솔베이트용액을 넣는다. vitaminB12 assay medium(Difco)을 사용할 수 있다.

㉰ 접종균액의 조제

Ⓐ Lactobacillus leichmannii의 보존균주

Lactobacillus leichmannii ATCC 7830은 배양배지에 천자배양(stab culture)한다. 37℃에서 6～24시간 배양하여 10℃의 암소에 저장한다. 분석하기 전 1～2주 간격으로 계속 배양하고, 최소한 1주일에 1번 정도로 새로 준비한다.

Ⓑ 액체배양배지

Peptonized milk 15g, 효모엑기스 5g, 포도당 10g, KH2PO4 2g을 600㎖의 물로 용해한다. 여기에 여과한 tomato juice 100㎖를 가한 후 NaOH로 pH를 6.5～6.8로 조정한다. 저으면서 10㎖의 폴리솔베이트80을 첨가하고 물로 희석하여 1ℓ로 만든다. Lactobacilli broth AOAC(Difco)를 사용할 수 있다. 1㎖당 1ng의 비타민B12를 포함하도록 동량의 물로 희석하여 시험관에 10㎖씩 분주한 후, 면전하여 121℃에서 15분간 멸균하여 빨리 식히고 냉장고에 보관한다.

Ⓒ 배양배지

액체배양배지 500㎖에 5～7.5g의 agar를 넣고 agar가 녹을 때까지 수욕상에서 젓는다. 뜨거운 상태에서 10㎖를 취하여 시험관에 넣고 121℃로 15분간 멸균한 후 똑바로 세워 빨리 식히고 10℃의 암소에 저장한다. Lactobacilli agar AOAC(Difco)를 사용할 수 있다.

Ⓓ 접종균액

L. leichmannii의 보관균주를 2개의 액체배양배지에 접종하여 37℃에서 6～24시간 배양 후 원심분리하여 상등액은 버리고 0.9% NaCl용액 또는 부유배지 10㎖로 3회 세척한다. 부유배지를 100% T로 고정하고 이에 대하여 판독할 때, 시험관 당 0.50～0.75의 건조량에 상응되는 T 값이 주어지도록 0.9% NaCl용액 또는 부유배지로 일정량을 희석한다. 이렇게 준비한 것을 접종액으로 한다.

㉱ 시험용액의 조제

Na2HPO4 1.3g, 구연산 1.2g, sodium metabisulfite(Na2S2O5) 1.0g을 넣은 용액 100㎖를 사용 전에 준비한다. 비타민B12의 농도가 50～100ng이 되도록 시료의 양을 취한 후 ㎖당 0.01에서 0.04ng의 비타민B12 최종분석 농도에서 추출용액을 sodium metabisulfite의 농도가 ㎖당 0.03㎎을 넘지 않도록 첨가한다. 액상으로 시료용액을 완전히 분산시키고 물로 비커의 아랫부분을 세정하여 혼합물을 121℃에서 10분간 멸균하여 식힌다. 만일 덩어리가 생기면 입자가 완전히 녹을 때까지 혼합물을 젓는다. 세게 흔들면서 pH를 4.5로 조정하고, 비타민B12의 농도가 ㎖당 0.2ng이 되도록 물로 희석하여 여과한다. pH를 6.0으로 조정한 후 물을 가하여 적당히 희석한 것을 시험용액으로 한다. 시험용액 1㎖는 비타민B12 0.014ng을 포함하도록 조제한다.

㉲ 시험조작

비타민B12의 표준용액과 분석용액의 계열을 다음과 같이 준비한다. 두 개의 시험관에 표준용액을 0(비접종 blank), 0(접종 blank), 1.0, 2.0, 3.0, 4.0과 5.0㎖씩 넣는다.

분석시료는 2개 시험관에 분석용액을 1.0, 2.0, 3.0, 4.0㎖씩 넣는다. 표준용액과 분석용액의 각 시험관에 물을 넣어 5㎖로 만든 후, 5㎖의 기초배지를 넣고 잘 섞는다. 면전하여 121℃에서 10분간 고압 멸균하여 빨리 식힌다. 비접종 공시험용 시험관을 제외한 각 시험관에 접종액 1방울씩을 무균적으로 접종하여 37℃에서 16～24시간 배양한다.

각 시험관의 내용물을 완전히 혼합하여 흡수 cell에 옮기고, 비접종 시험관의 투과도를 100%로 고정하여 각 시험관의 투과도를 구한다. 시아노코발아민 표준계열에 의한 흡광도의 평균치로부터 검량선을 작성한다. 표준곡선으로부터 분석용액의 각 시험관의 비타민양을 정한다. 표준용액의 T값이 0.5㎖이하 또는 4.5㎖이상으로 관찰되면 무시한다. 시험에 사용한 분석용액의 농도(비타민함량/㎖)를 계산한다. 각 시험관 결과치의 평균을 구하되, 평균으로부터 10%이내의 오차를 보이는 결과만을 취하여 계산한다. 분석용액의 4단계에 사용한 시험관중 2/3미만이 적합한 결과를 보인 경우, 이 결과는 시료의 비타민B12 함량 결정에는 불충분하다. 2/3이상의 시험관의 결과가 적합한 경우라면, 그 평균값으로부터 시료의 역가를 구한다.

⑥ 콜린

㉮ 시약

Ⓐ 콜린 표준용액 : 80℃에서 24시간 감압 건조한 염화콜린 표준품을 정밀하게 취하여 염화콜린으로서 5㎍/㎖의 수용액으로 조제하여 냉소에 보관한다.

Ⓑ 비오틴용액 : 비오틴 25㎎을 물에 용해해서 1,000㎖로 만든 후 이 중 40㎖를 취해 물을 가하여 1,000㎖로 만든다. 이 용액 1㎖는 비오틴 1㎍을 포함한다.

Ⓒ 염류용액 : H3BO3 0.01g, Na2MoO4․2H2O 0.02g, FeSO4․7H2O 0.2g, CuSO4․5H2O 0.08g,  MnSO4․4H2O 0.02g 및 ZnSO4․7H2O 1.8g을 물에 녹여 1ℓ로 한다. 톨루엔을 가하여 보관한다.

㉯ 기초배지의 조제

자당 20g, 주석산 암모늄 5g, 질산암모늄(NH4NO3) 1g, 제일인산칼륨(KH2PO4) 1g, 황산마그네슘(MgSO4․7H2O) 0.5g, 염화나트륨(NaCl) 0.1g, 염화칼슘 0.1g, 비오틴용액 5㎖, 염류용액 5㎖ 및 물 400㎖를 가하고, 가열하여 용해시키고, 10% 염산으로 pH를 5～5.2로 조정하고, 물을 가하여 500㎖로 한다. 불용물질이 있으면 여과한다. 또는 이와 동등한 합성배지를 사용할 수 있다.

㉰ 접종균액의 조제

Ⓐ Neurospora crassa 의 보존균주

: 기초배지 100㎖에 효모엑기스 0.4g, 맥아엑기스 0.4g, 염화콜린 1㎎ 및 물 100㎖를 가하여 용해하고, 여기에 한천 3g을 가하여 수욕상에서 가열용해한다. 식기전에 이 액 10㎖씩을 시험관에 넣어 면전하고, 1㎏/㎝2로 10분간 가압멸균하고, 방냉하여 사면배지를 만든다. Neurospora crassa No. 34486(콜린 요구성 변이주)의 순수배양을 이용하여 배지에 접종하고, 30℃로  3일간 배양하여, 실내에 1일간 방치하여 포자를 형성시킨 후, 냉소에 보관한다. 보존균주는 2주마다 다시 조제한다.

Ⓑ 접종균액 : Neurospora crassa의 보존균주에 멸균 0.9% 염화나트륨용액 10㎖를 가하여, 잘 흔들어 섞어 포자를 부유시켜, 이 액을 접종균액으로서 사용한다.

㉱ 시험용액의 조제

미세하게 분쇄한 검체 일정량을 삼각플라스크에 넣고, 여기에 검체의 적어도 10배량의 0.1N 황산용액을 가하여, 수욕상에서 약 15분간 가열 추출한다. 냉각 후 10% 수산화나트륨용액을 이용하여 pH를 약 5로 조정한 후, 물을 가하여 일정량으로 하여, 여과 또는 원심분리하여 상등액을 얻고 이에 물을 가하여 적당히 희석하여 용액 1㎖ 중에 콜린 약 5㎍을 함유하도록 조제한다.

㉲ 시험조작

200㎖의 삼각플라스크 각 2개씩에 콜린 표준용액 0, 1.0, 2.0, 3.0, 4.0 및 5.0㎖를 넣고 각 플라스크에 기초배지 10㎖ 및 물을 가하여 20㎖로 하여 표준용액계열로 한다. 별도로 200㎖의 삼각플라스크 각 2개씩에 시험용액 2.0, 3.0 및 4.0㎖를 가하여, 각 플라스크에 기초배지 10㎖ 및 물을 가하여 20㎖로 하여 시험용액계열로 한다. 각 계열의 플라스크 내용액을 잘 혼합하여, 뚜껑 또는 작은 비커를 덮은 후, 1㎏/㎝2로 5분간 가압멸균하여, 냉각 후 각 플라스크에 접종균액 1방울씩을 무균적으로 접종하고 30℃로  3일간 배양기에서 배양한다.

배양후에는 균의 증식을 멈추게 하기 위해서, 100℃에서 5분간 가열한다. 균의 증식도를 측정하기 위해서, 각 플라스크로부터 균사체를 미리 90℃에서 2시간 건조한 여과지로 여과하여 가능한 한 수분을 제거하여, 90℃로 2시간 건조한 후 건조균사체의 중량을 측정한다. 얻어진 값에 환산계수 0.868을 곱하여 콜린의 함량을 구한다.

⑦ 비오틴

㉮ 시약

Ⓐ 비오틴 보존용액

비오틴 표준품을 50% 에탄올에 녹여, 그 1㎖에 비오틴 20㎍이 함유되도록 한다. 이 용액은 냉소에 보관한다.

Ⓑ 비오틴 표준용액

사용 시 비오틴 보존액을 물로 희석하여, 그 1㎖에 비오틴 0.2㎍이 함유되도록 한다.

Ⓒ 카제인 산분해액 : ① 일반정량조작법 ㉲ 정량용 기초배지에 따른다.

Ⓓ 아데닌․구아닌․우라실용액 : ③ 엽산 ㉮ 시약에 따른다.

Ⓔ 시스틴․트립토판용액 : ③ 엽산 ㉮ 시약에 따른다.

Ⓕ 비타민B1․비타민B2용액

비타민B1염산염, 비타민B2를 0.02 N 초산에 녹여, 그 1㎖가 비타민B1염산염 10㎍ 및 비타민B2 20㎍을 함유하도록 한다. 이 용액은 톨루엔을 소량 가하여, 빛을 차광하여 냉소에 보관한다.

Ⓖ p-아미노안식향산․니코틴산․판토텐산칼슘․비타민B6 용액

이 용액 1㎖가 p-아미노안식향산 10㎍, 니코틴산 20㎍, 판토텐산 칼슘 20㎍, 피리독신염산염 40㎍을 함유하도록 25% 에탄올에 녹인다. 이 용액은 냉소에 보관한다.

Ⓗ 염류용액 A 및 B : ① 일반정량조작법 ㉲ 정량용 기초배지에 따른다.

㉯ 기초배지

카제인산분해용액 10㎖, 시스틴․트립토판용액 10㎖, 아데닌․구아닌․우라실용액 2㎖, 비타민B1․비타민B2용액 2㎖, p-아미노안식향산․니코틴산, 판토텐산 칼슘․비타민B6 용액 2㎖, 염류용액 A 2㎖ 및 염류용액 B 2㎖를 혼합하고, 이것에 무수 포도당 4g 및 무수초산나트륨 2g을 가하여 물에 용해하고, 10% NaOH용액으로 pH 6.8로 조정하고, 물을 가하여 전량 100㎖로 한다. 불용물질이 있으면 여과한다. 또는 이와 동등한 합성배지를 사용할 수 있다.

㉰ 접종균액의 조제

Ⓐ Lactobacillus plantarum 보존균주

효모엑기스 0.5g, 펩톤 1g, 포도당 1g 및 초산나트륨(3H2O) 1g을 물 60～70㎖에 녹여, 1～2분 끓인다. 냉각 후, 염류용액 A 및 B 각 0.5㎖를 가하고 10% 수산화나트륨용액으로 pH 6.8로 조정하고, 물을 가하여 100㎖로 하고, 이것에 분말한천 2g을 녹여, 10～15㎖씩 시험관에 분주하여 1㎏/㎝2로 15분간 가압 멸균하여, 시험관을 수직으로 보존하여 방냉한다. Lactobacillus plantarum ATCC No. 8014의 순수배양에서 상기의 균주보존용배지에 균을 접종하고, 37℃에서 16～24시간 배양하여, 냉소에 저장하여, 1주간마다 이식한다.

Ⓑ 접종용배지

Ⓐ의 균주보존용배지의 조제법에 따라서, 최후에 분말한천을 가하지 않고 불용잔사를 여과하여 없애고 5㎖씩 시험관에 분주하고 1㎏/㎝2 15분간 가압멸균하여 방냉하여 접종용배지로 한다.

Ⓒ 접종균액

Lactobacillus plantarum의 보존균주를 접종용배지에 이식하고, 37℃에서 16～24시간 배양하고, 증식한 균액을 무균적으로 원심분리 한 후, 상등액을 비스듬하게 하여 제거하고, 여기에 멸균생리식염수 약 5㎖로 현탁시켜 다시 원심분리하여 상층액을 제거하고, 이 조작을 2회 반복하여 균을 세정한다. 세정이 끝난 균액을 멸균생리식염수로 10～100배로 희석하여 접종균액으로 한다.

㉱ 시험용액의 조제

비오틴 약 200㎍을 함유하는 시료를 50㎖의 삼각플라스크에 취하고 6N 황산용액 25㎖를 가하여 1㎏/㎝2로 1시간 가압한다. 냉각 후, 10% 수산화나트륨용액으로 pH 6.8로 조정하고, 원심분리 또는 여과한 후 물을 가하여 용액 1㎖ 중에 비오틴 약 0.2㎍을 함유하도록 희석한다.

㉲ 시험조작

시험관 각 2개씩에 비오틴 표준용액 0, 0.25, 0.5, 1, 1.5, 2.0 및 2.5㎖를 넣고, 각 시험관에 기초배지 2.5㎖ 및 물을 가해 전량을 5㎖로 하여 표준용액 계열로 한다.  별도로 시험관 각 3개씩에 시험용액 0.5, 1 및 2㎖를 취하고 각 시험관에 기초배지 2.5㎖ 및 물을 가해 전량을 5㎖로 한 것을 시험용액 계열로 한다. 양계열의 시험관의 내용물을 잘 혼합하여, 알루미늄 뚜껑을 씌우고, 1㎏/㎝2로 10분간 가압 멸균한다. 냉각 후, 각 시험관에 접종균액을 1 방울씩 무균적으로 접종하고, 산도적정에 의한 정량에는 37℃, 72시간, 탁도측정에 의한 정량에는 37℃, 16～24시간 배양한다. 배양 후, 각 시험관에 생긴 산 또는 탁도를 (5) 니코틴산 ② 미생물학적 시험법 ㉴ 시험조작에 따라 산도적정 또는 탁도측정에 의해 정량한다.

11. 방사능 잠정허용기준시험법

본 시험방법은 방사성 물질 중 감마선방출 방사성물질을 검색하는 것으로 위생상 중요 문제가 되는 핵종을 주 대상으로 한다. 또한 검출한계와 정량감도의 범위는 시료의 방사능오염이 위생상 문제가 되는 농도 범위로 한다.

1) 전처리방법

핵종분석 및 방사능계측을 수행하기 전 시료를 측정에 적합한 상태로 만들기 위하여 다음과 같이 처리한다.

(1) 직접법

① 가공원료

㉮ 분말인 경우 측정용기에 압축하여 넣고 상면이 수평이 되도록 고르게 한다.

㉯ 측정용기에 충전된 시료의 중량(측정용기의 중량은 제외)을 정밀히 달고 밀봉하여 시료표본으로 한다.

㉰	액체(추출물 포함)인 경우 그대로 측정용기에 넣고 중량을 정밀히 달아 밀봉하여 시료표본으로 하거나 적당량으로 농축해 측정용기에 넣고 중량을 정밀히 달아 밀봉하여 시료표본으로 한다.

② 가공제품

㉮ 시료가 균등하게 되도록 분쇄기로 갈아(거품이 발생하는 경우 알코올을 넣어 거품을 제거) 측정용기에 넣고 중량을 정밀히 달아 밀봉하여 시료표본으로 한다.

㉯ 측정 중 부패의 우려가 있는 경우 포르마린(포름알데하이드 37%용액)을 2㎖/ℓ비율로 첨가하고 밀봉하여 시료표본으로 한다.

③ 자연산물

㉮ 시료가 균등하게 되도록 분쇄기로 갈아 측정용기에 다져 넣고 전항과 같이 처리한 후 중량을 측정한다.

㉯ 측정 중 부패의 우려가 있는 경우 ②항 ㉯와 같이 처리하여 시료표본으로 한다.

④ 곡류 등

㉮ 식용으로 쓰이지 않는 부분(껍질 등)이 있는 경우 이를 제거하고 분쇄기로 갈아 분말로 만든다.

㉯ 이 분말을 측정용기에 넣고 검출효율을 높이기 위해 압축하여 체적을 최소화 시키고 상면이 수평이 되도록 고르게 한다.

㉰ 측정용기에 충전된 시료의 중량(측정용기의 중량은 제외)을 달아 이를 시료 표본으로 한다.

⑤ 채소류 등

㉮ 식용으로 쓰이지 않는 부분(뿌리, 토사, 고엽 등)을 제거(물로 세척할 경우 물기를 제거)한 후 믹서기로 갈아 균질한 분포가 되게 만든다.

㉯ 이때 거품이 발생되므로 에틸알코올을 여러 방울 적하하여 거품을 제거한다.

㉰ 측정중 부패의 우려가 있는 경우 포르마린(포름알데하이드 37%용액)을 시료 1ℓ에 대하여 2㎖를 첨가할 수 있다.

㉱ 상기용액을 측정용기에 넣고 시료의 중량을 정밀히 달고 밀봉하여 시료표본으로 한다.

⑥ 식육류 등

㉮ 식육류 등은 식용으로 쓰이지 않는 부분(뼈, 껍질, 비계, 가시 등)이 있을 경우 이를 제거하고 분쇄기 또는 믹서기로 갈아 균질한 분포가 되도록 한다.

㉯ 측정 중 부패의 우려가 있는 경우 포르마린(포름알데하이드 37%용액)을 시료 1㎏에 2㎖를 가할 수 있다.

㉰ 측정용기에 그대로 옮기고 기포를 제거하기 위하여 다져 넣어 체적을 최소화한다.

㉱ 상기 시료의 중량을 달고 밀봉하여 이를 시료표본으로 한다.

⑦ 우유류

㉮ 우유류 등은 원유인 경우 측정 중 부패로 인한 유정의 분리를 방지할 필요가 있을 때 1ℓ에 포르마린(포름알데하이드 37%용액)을 10㎖ 가한다.

㉯ 이것을 측정용기에 그대로 옮기고 밀봉한다.

㉰ 유제품(분말)인 경우 그대로 측정용기에 넣고 용기의 가장자리를 가볍게 두드려 내용물이 균등하게 분포되도록 한 후 체적이 최소화되도록 다지고 상층을 수평이 되게 한다.

㉱ 상기 시료의 중량을 달고 밀봉하여 이를 시료표본으로 한다.

(2) 건조법

① 수분이 많은 시료는 1～2일간 바람에 건조시키고

② 분쇄하기 쉬울 때까지 105℃의 열풍건조기내에서 건조한다.

③ 충분히 건조된 것은 습기가 재흡수되기 전에 분쇄기를 사용하여 분말로 만든다.

④ 측정용기에 분말을 넣고 균질한 분포가 되도록 압축하여 체적을 최소화시킨 후 중량을 달고 밀봉하여 이를 시료표본으로 한다.

⑤ 건조전후의 중량비로 결과를 환산한다.

(3) 회화법

① (2)의 ①～②까지 처리된 시료를 전열기 또는 가스버너로 온도가 너무 높지 않도록 주의하면서 가연성가스가 나오지 않게 될 때까지 탄화한다.

② 탄화된 것을 회화로에 넣고 500℃를 넘지 않는 온도로 회화하여 쉽게 잿가루가 될 수 있는 정도로 만든다.

③ 회화된 것을 막자사발에서 충분히 분쇄 혼합하여 측정용기에 압축하여 넣는다.

④ 상기 시료의 중량을 달고 밀봉하여 이를 시료표본으로 한다.

⑤ 건조 전 및 회화전후의 중량비로 결과를 환산한다.

2) 방사능 핵종시험

다중파고분석기와 고순도 게르마늄 검출기를 사용하여 다음과 같이 시험한다.

(1) 사용 장치의 명칭, 형식, 측정조건, 시료의 명칭, 종류, 상태 등을 기록한다.

(2) 측정 장치의 전원을 가하고 기저방사능을 측정한다.

(3) 시료의 최소 측정시간은 10,000초로 한다. 측정조건에 따라 측정시간을 증가시킬 수 있다.

(4) 기저방사능을 시료측정 전후로 측정하여 평균치를 취한다.

(5) 표준선원의 에너지피크를 구하고 측정에너지 범위가 0～2MeV가 되도록 증폭기의 게인을 조정한다. 필요한 경우 측정에너지 범위를 확대 또는 축소하여도 좋다.

(6) 각 채널에 대응하는 에너지를 표준선원을 이용하여 교정한다.

(7) 차폐용기내의 검출기에 시료를 올려놓고 일정시간 방사능을 측정하여 스펙트럼을 얻는다.

(8) 나타난 피크에너지에 대응하는 동위원소를 동위 원소표에 있는 것과 대조하여 핵종을 찾는다.

3) 방사능시험

(1) 상기 2)의 (1)～(7)을 행한다.

(2) 얻어진 스펙트럼을 참조하여

Ｉ-131[0.0802(2.6%), 0.284(6.1%), 0.364(81%), 0.637(7.3%) MeV]

Cs-134[0.569(15%), 0.605(98%), 0.796(85%) MeV]

Cs-137[0.662(85%) MeV]

에서 감마선 방출비율이 가장 큰 각 핵종에 대한 피크에너지(0.364, 0.605, 0.662MeV)의 3배 반치폭을 피크에너지 영역으로 하고 낮은 에너지측의 L채널, 높은 에너지측의 H채널을 취하여 피크면적을 다음식으로 구한다.

[eqn: SUM from { { i＝L＋1}} to {H-1}][eqn: rm{H-L-1} over {6}][eqn: LEFT [ SUM from { { i}=L-2} to L `N i + SUM from { { i}=H} to H+2 ` N i ~RIGHT ]]

S ＝     Ni -

Ni：채널 i에서의 계수 값

(3) 감마계수효율 ε은 피측정 검체와 같은 형상(가능하면 동일조성의 동일 형상)으로 만들어진 표준선원에 따라 구한다. 이때 몇 개의 에너지에 대한 효율 ε을 구하여 에너지와 효율과의 관계를 log-log방안지에 그리면 에너지 0.15MeV영역에서 거의 직선상의 그래프가 얻어진다. 이 그래프로부터 목적하는 에너지에 대한 계수효율을 내삽으로 구할 수 있다.

(4) 각 핵종에 대한 방사능 A는 다음 식으로 산출한다.

[eqn: rm A＝{S} over { epsilon pt}] Bq

ε：에너지피크에서의 감마계수효율

p ：동에너지의 감마방출률

t   ：측정시간(초)

(5) 얻어진 결과의 표준편차  A는 다음식으로 산출한다.

[eqn: rm DELTA A=A{ SQRT { SG+K^2`SB} } over { S}]

여기서

SG ＝[eqn: SUM from { { i＝L＋1}} to H-1]  Ni, SB ＝[eqn: SUM from { { i}=L-2} to L] Ni ＋ [eqn: SUM from { { i}=H} to H+2] Ni

K ＝[eqn: rm{H-L-1} over { 6}]

12. 내용량 시험법

1) 용량표시제품

검체의 내용물을 메스실린더에 완전히 옮겨 측정한다. 다만, 점성 등이 있어 내용물을 완전히 옮기기 어려운 검체에 대해서는 내용물이 들어 있는 용기에 물을 적가하여 용기를 가득 채웠을 때의 양을 측정하고, 용기의 내용물을 제거하여 물 또는 적당한 용매로 용기의 내부를 깨끗이 씻어 말린 후 물을 적가하여 용기를 가득 채웠을 때의 양을 측정하여 전후의 용량차로 계산한다(검체 3개를 가지고 시험하여 평균값을 내용량으로 한다).

2) 중량표시제품

내용물이 들어있는 용기 외면을 깨끗이 닦고 무게를 정밀히 측정 후, 내용물을 완전히 제거하고 물 또는 용매 등으로 용기의 내부를 깨끗이 씻어 말린 후 용기의 무게를 달아 전후의 무게차로 계산한다(검체 3개를 가지고 시험하여 평균값 내용량으로 한다). 다만, 내용량에 포함된 흡습제 등 비가식 대상은 제외한다.

3) 소포장제품

내용물이 소포장으로 20개 이하일 경우에는 전체를, 20개 이상일 경우에는 20개를 무작위로 취해 위와 같이 실험하여 평균값을 구한 후 전체 개수를 곱하여 총량으로 계산한다.

4) 캅셀제품

(1) 경질캅셀제품

표시된 검체의 전체 개수를 확인한 후, 캅셀 20개를 취하여 무게를 측정하고, 캅셀을 열고 내용물을 작은 붓등을 사용하여 제거하고 빈 캅셀의 무게를 측정한 후 전후의 무게차를 20으로 나눈 평균값을 캅셀당 무게로 하여 캅셀별로 무게와 총 개수에 대하여 각각 판정한다.

(2) 연질캅셀제품

표시된 검체의 전체 개수를 확인한 후, 캅셀 20개를 취하여 무게를 측정하고, 캅셀을 절개하여 그 내용물을 에테르 등의 휘발성 용매로 씻은 다음 여과지 등으로 빈 캅셀로부터 용매를 가볍게 제거하고 실온으로 30분 이상 방치하여 캅셀에 묻어 있는 용매를 제거하여(이 때 캅셀이 흡습 또는 건조되는 것을 피한다) 빈 캅셀의 무게를 측정한 후, 전후의 무게차를 20으로 나눈 평균값을 캅셀당 무게로 하여 캅셀별의 무게와 총 개수에 대하여 각각 판정한다.

5) 통조림제품

내용물이 들어있는 관 외면을 깨끗이 닦고 무게를 정밀히 단후 뚜껑의 일부분이 관에 붙어있게 개관한다. 관(액즙이 응고한 경우에는 20℃로 가온하여 액을 용해한 관)을 비커에 2분간 비스듬히 올려놓아 액즙이 충분히 흘러내리게 한 후 내용물이 든 관의 무게(B)를 단다. 다음에 내용물을 완전히 제거하고 물 등으로 용기의 내부를 깨끗이 씻어 말린 후 무게(C)를 달아 (A)와 (C)의 무게차 및 (B)와 (C)의 무게차를 각각 내용량 및 고형량으로 한다(검체 3개를 가지고 시험하여 평균값을 내용량 및 고형량으로 한다). 다만, 내용량이 관용적을 기준(예：관용적의 90%이상)으로 하여 관용적을 계산할 필요가 있을 때에는 원체부의 높이가 변하지 않도록 관의 뚜껑을 제거하여 내용물을 완전히 비운 후 4℃의 물을 관의 최상면에서 수직으로 4.76㎜(2중 관체내면)까지 채운 양을 관용적으로 한다. 이 때 고형량의 계산(예：내용량의 70% 이상 등)은 내용량 기준에 대한 계산을 말한다.

13. 진공도시험법

오른손의 엄지와 인지 사이에 진공계를 잡고 진공계의 침(고무가 부착된 부분)을 관 뚜껑 역륜(Expansion Ring)의 볼록한 부분에 밀착 삽입시켜서 진공도를 측정한다. 이 때 진공계의 끝이 관 뚜껑에 밀착하도록 주의하고 측정시의 통조림의 온도는 15℃에서 한다.

다만, 타원형 혹은 사각형의 통조림에 있어서는 관 내용물이 진공계의 침공을 폐쇄시킬 수 있으므로 이 때는 관을 세워 그 타원의 한쪽을 위로해서 그 중심부에 진공계의 침을 밀착 삽입시켜서 그 진공도를 측정한다.

14. 입도시험법

1) 과립제품

12호(1680㎛), 14호(1410㎛) 및 45호(350㎛) 체를 써서 시험한다. 다만 이 시험법에 쓰는 체틀의 안지름은 75㎜로 한다. 검체 20.0g을 정확하게 달아 앞에서 지정한 체 및 수기(受器)를 겹쳐놓은 용기의 상단 체에 넣고 뚜껑을 덮은 다음 3분간 수평으로 흔들어 주면서 때때로 가볍게 두드려준 다음 각 체 및 수기 내 잔류물의 질량을 단다. 12호(1680㎛) 체를 전량 통과하고 14호(1410㎛) 체에 남는 것은 전체량의 5% 이하이고 또 45호 (350㎛) 체를 통과하는 것은 전체량의 15% 이하일 때 적합하다.

15. 기타 시험법

1) 산도

검체 0.5g에 탄산가스를 함유하지 않은 물 50㎖를 가하고 페놀프탈레인 시액 0.5㎖를 가하여 0.1N 수산화나트륨용액으로 30초간 홍색이 지속될 때까지 적정한다.

[계산식]

산도(1N NaOH ㎖/100g) ＝[eqn: rm { a×f×10} over { 검체채취량(g)}]

a : 0.1N NaOH 용액의 소비 ㎖수

b : 0.1N NaOH 용액의 역가

2) 유기산도

검체 1g에 끓여서 식힌 물 100㎖를 가하여 이에 페놀프탈레인시액 0.5㎖를 가한 후 0.1N 수산화나트륨용액으로 30초가 홍색이 지속될 때까지 적정하고 다음 식에 따라 유기산 산도(%)를 구한다. 시험용액이 착색되어 있는 경우는 pH측정기를 사용하여 pH8.3까지 적정한다.

[계산식]

[eqn: rm유기산산도(구연산으로서,~%)={{a×f×0.0064}over{검체채취량(g)}}×100]

a : 0.1N 수산화나트륨액의 소비량(㎖)

f : 0.1N 수산화나트륨액의 역가

3) 시안화합물

① 시약

㉮ 구연산완충액 : 구연산 128.1g 수산화나트륨 64.4g을 물에 용해시켜 1,000㎖로 하고 pH 5.9로 조정한다.

㉯ 피크린산지 : 여지를 포화 피크린산용액에 담그고 실온에서 건조한 후 7×40㎜의 크기로 잘라서 사용시 10% 탄산나트륨용액에 담근다.

② 시험조작

검체 20g을 200㎖ 삼각플라스크에 취하여 구연산완충액 50㎖를 가하여 피크린산지를 매달은 코르크 마개로 밀전하여 25~35℃에서 때때로 조용히 흔들어 혼합시키면서 3시간 방치한 후 주석산 2g을 가하고 위의 코르크 마개를 빨리 밀전하고 때때로 흔들어 혼합시키면서 50~60℃에서 1시간 방치할 때 시안화합물이 존재하면 피크린산지는 밝은 적색으로 변한다

4) 카라멜 색소

① 시약

㉮ 펙틴용액 : 펙틴 1g을 물 75㎖에 녹인 다음 에탄올 25㎖를 가하여 전량을 100㎖로 한다. 사용시에는 흔들어 사용한다.

㉯ 페닐히드라진용액 : 2, 4-디니트로페닐히드라진 1g을 황산 7.5㎖에 녹이고 에탄올을 가하여 75㎖가 되게한다.

② 시험

검체 약 5g을 물에 녹여 여과한 여액 10㎖를 바브콕크림병(babcock cream bottle) 또는 원심분리관에 넣고 펙틴용액 1㎖를 가하여 섞은 후 염산 3~5 방울을 넣어 잘 섞고 에탄올 50㎖정도로 채워 원심분리한 후 상징액을 버린다.

침전물은 물 10㎖에 녹여 염산 및 에탄올로 위와 같은 조작을 에탄올층의 색깔이 없어질 때까지 반복한다.

이 젤라틴성 잔류물을 끓는 물 10㎖에 녹여 갈색이 되면 2,4-디니트로페닐히드라진용액 1㎖를 넣고 잘 섞어 수욕중에서 30분간 가열한다. 이때 침전물이 발생하면 카라멜 색소가 있는 것으로 한다.

5) 물불용성 침전물

검체 1g을 정밀히 달아 물 10㎖에 녹인 후 미리 건조하여 항량으로 한 원심분리관에 옮기고, 검액을 씻은 액을 합하여 15㎖로 한다. 3,000rpm으로 15분간 원심분리하고 상징액을 버리고 다시 물을 넣어 위와 같은 조작을 3회 반복한 후 원심분리관을 105℃에서 2시간 건조하고 데시케이터에서 방냉한 후 칭량한다. 물불용성 침전물의 함량은 다음식에 따라 구한다.

6) 단백질응고시험

검체 1g을 취해 물 10㎖에 현탁시킨 후 여액을 묽은 초산(1→10) 수방울 가할 때 또는 가열할 때 교질상 침전이 생성된다.

7) 산도(젖산으로서)

검체 10g에 끓여 식힌 물 100㎖를 가하고 이에 페놀프탈레인시약 0.5㎖를 가하여 0.1N 수산화나트륨으로 30초간 홍색이 지속될 때까지 적정하고 다음 식에 따라 산도를 구한다. 시험용액이 착색되어 있는 경우에는 pH측정기를 사용하여 pH 8.3까지 적정한다.

[계산식]

유기산 산도(%)(젖산으로서)＝[eqn: rm { a×f×0.009} over {검체채취량(g) }]×100

a∶0.1N 수산화나트륨액의 소비량(㎖)

f∶0.1N 수산화나트륨액의 역가

8) 효모수

검체 일정량을 취하여 멸균생리식염수로 최소 구획 중의 세포수가 5개 전‧후가 되도록 희석하여 혈구계산판(Bürkei-Türk형)에 일정량을 주입하고 검경하여 일정 구간내의 효모수를 측정하고 이 값에서 검체 1㎖ 중의 효모수를 산출한다.

* 혈구계산판을 이용한 계수법

용액 중의 효모 및 사상균 포자수의 측정에 적용한다.

Ⓐ기구∶혈구계산판 Bürkei형으로 Türk의 분획을 가지는 것(Bürkei-Türk형)

Ⓑ시험용액의 조제∶다음의 검경을 행할 때 최소구획 중의 세포수가 5개 전‧후가 되도록 생리식염수를 희석한다.

Ⓒ시험조작∶시료를 혈구계산판에 주입하고 검경하여 일정 구간내의 진균수를 측정한다. 이 값에서 검체 1㎖ 중의 진균수를 산출한다.

9) 시트리닌

① 표준용액의 조제

시트리닌 표준품 10㎎을 정밀하게 달아 메탄올로 100㎖로 하여 표준원액을 만든다(100㎍/㎖). 표준원액을 메탄올로 희석하여 표준용액을 제조한다(0.01㎍/㎖)

② 시험용액의 조제

홍국 약 2.5g을 정밀하게 달아 에탄올 20㎖을 넣은 다음 30분간 초음파 처리한다. 추출액을 원심분리한 후 그 상징액을 취하여 감압농축한 뒤 메탄올 1㎖에 녹여 0.45㎛ 멤브레인필터로 여과한 것을 시험용액으로 한다.

③ 시험조작

㉮ 고속액체크로마토그래피 조건

- 칼럼 : 옥타데실실릴화한 실리카겔을 충전한 칼럼(ODS 칼럼, 4.6㎜×250㎜) 또는 이와 동등 이상의 것

- 검출기 및 파장 : 형광검출기(여기파장 335㎚, 측정파장 502㎚)

- 유속 : 1.0㎖/min

- 이동상 : 0.1% 삼불화초산(TFA)용액 : 아세토니트릴 (65 : 35)

㉯ 정량시험

표준용액과 시험용액을 각각 10㎕씩 주입하여 앞의 조건에서 시험한다. 표준용액 중 시트리닌의 머무름시간과 일치하는 시험용액 중 피크를 확인한 후 다음 식에 따라 검체 중의 시트리닌 함량을 구한다.

[계산식]

[eqn: rm시트리닌(㎍/㎏)=C×{Psa}over{Pst}×{V}over{W}×1,000]

C : 표준용액의 농도(㎍/㎖)

Pst : 표준용액 중 시트리닌의 피크 면적

Psa : 시험용액 중 시트리닌의 피크 면적

V : 시험용액의 전량(㎖)

W : 검체량(g)

10) 입도

검체 5g을 정밀히 달아 표준체에 넣고 체 진탕기로 5분간 흔든 후 체를 통과한 양을 다음식에 따라 계산한다.

[계산식]

입도(%)＝[eqn: rm { A} over {S } × 100]

A: 체 통과량의 무게(g)

S: 검체의 무게(g)

제3장 건강기능식품별 시험방법

Ⅰ. 단백질류

1. 단백질

항목	규격	시험방법
성상	고유의 색택과 향미를 가지며 이미․이취가 없어야 함	-
조단백질(g)	표시량의 80.0% ~ 120.0%	제2. 1. 3). 1
수분(%)	10.0 이하	제2 . 1. 1)
납(㎎/㎏)	3.0 이하	제2. 5. 3). (2)
세균수	1㎖당 100 이하	제2. 7. 2)
대장균군	음성	제2. 7. 5)

2. 대두단백

항목	규격	시험방법
성상	고유의 색택과 향미를 가지며 이미․이취가 없어야 함	-
대두단백(%)	표시량의 80.0~120.0%	제2. 1. 3). (1)
대두단백 확인	다이드제인 및 제니스테인이 확인	대두단백 확인
수분(%)	8.0이하 (단, 액상제품은 제외)	제2. 1. 1)
조지방(%)	5.0이하	제2. 1. 4)
대장균군	음성	제2. 7. 5)

(1) 대두단백 확인

① 표준용액의 조제

다이드제인, 제니스테인 표준품을 각 20mg씩 정밀하게 취하여 메탄올 50㎖에 녹여 표준용액으로 한다.

② 시험용액의 조제

검체 약10g을 달아 250㎖ 삼각플라스크에 넣고 80% 메탄올 40㎖를 넣은 후 호일을 씌우고 65℃ 항온 수욕조에서 2시간 추출한다. 냉각시킨 후 2M 수산화나트륨용액 3㎖를 넣고 상온에서 10분간 회전 교반하여 반응시킨 다음 빙초산 1㎖를 넣는다. 80% 메탄올을 사용하여 50㎖로 한 다음 잘 혼합하고 여과한다. 여액 5㎖에 물 4㎖를 넣고 메탄올을 사용하여 10㎖로 한다. 5분간 원심분리한 상징액을 0.45㎛ 멤브레인필터로 여과한 것을 시험용액으로 한다.

③ 시험조작

㉮ 고속액체크로마토그래피(HPLC) 측정조건

- 칼럼 : 옥타데실실릴화한 실리카겔을 충전한 칼럼(ODS 칼럼, 4.6㎜×250㎜)

- 검출기 및 파장 : 자외부검출기(UV) 260nm

- 유속 : 1.0㎖/min

- 이동상 : A액 - 물:메탄올:초산(88:10:2)

B액 - 메탄올:초산(98:2)

시간(분)	A(%)	B(%)
0	90	10
21	60	40
32	60	40
35	40	60
36	90	10
50	90	10

㉯ 확인

표준용액과 시험용액을 각각 10㎕씩 주입하여 앞의 조건에서 시험한다. 표준용액 중 제니스테인, 다이드제인과 머무름시간이 일치하는 시험용액 중의 피크를 확인한다.

3. 로얄젤리

항목	규격			시험방법
	생로얄제리	동결건조로얄제리	로얄젤리제품
성상	고유의 색택과 향미를 가지며 이미․이취가 없어야 함			-
10-히드록시-2-데센산 (%)	표시량 이상			10-히드록시-2-데센산
조단백질(%)	11.0~14.5	30.0~41.0	-	제2. 1. 3). (1)
수분(%)	65.5~68.5	5.0이하	-	제2. 1. 1). (3) 혹은 제2. 1. 1). (4)
산도 (1N NаOH ㎖/100g)	32 ~ 53	-	-	제.2. 15. 1)
대장균군	음성			제2. 7. 5)

(1) 10-히드록시-2-데센산(10-HDA)

① 표준용액의 조제

10-HDA 표준품을 황산데시케이터에서 건조시킨 후 약 50㎎을 정밀히 취하여 넣고 메탄올로 녹여 500㎖로 한 것을 표준원액(100ppm)으로 하여 필요시 희석하여 사용한다.

② 시험용액의 조제

10-HDA로서 48㎎에 해당하는 양의 검체(연질캅셀 제품은 내용물과 피막을 함께 취한다)를 취하여 500㎖ 용량 플라스크에 넣고, 물 약 50㎖를 넣어 50℃로 가온하고 진탕 혼합하고, 연질캅셀은 피막과 내용물을 균질하게 혼합시킨 후 메탄올 약350㎖를 넣어 약 30분간 초음파 진탕 추출하고 메탄올을 넣어 500㎖로 한다. 이 액을 여과하여 검액으로 한다.

캅셀 제품의 경우에는 20캅셀 이상을 취하여, 캅셀을 절개하고 개개의 내용물의 무게를 정밀하게 달아 평균무게를 구하여 1캅 셀의 평균무게로 한다.

③ 시험조작

㉮정량시험

검액 및 표준액 10㎕를 액체크로마토그래프내에 주입하여  10-HDA의 그래프를 얻는다. 이 그래프를 표준 그래프와 비교하여 10-HDA에 해당하는 피크를 확인한다. 10-HDA의 함량은 피크의 면적 또는 높이로 다음 계산식에 따라 산출한다.

[계산식]

[eqn: rm 10-HDA 함량(%)={ "검액 중의 10ꠀHDA의 피크면적"} over { "표준액중의 10ꠀHDA의 피크면적" } × {" 표준품 취한 량(mg) "} over {" 검체채취량(mg)"}×100]

[장치 및 시험조건]

- 장치 : 고속액체크로마토그래프

- 칼럼 : μ-Bondapak C18 또는 이와 유사한 칼럼

- 이동상 : 0.02M (NH4)2HPO4․메탄올(7 : 3) 혼합액

(단, 인산을 가하여 pH 7.0으로 조정한다.)

- 검출기 : UV 214㎚

- 유속 : 1.4 ㎖/min

(유속은 10-HDA 주피크의 유지시간이 7~10분 되도록 적절히 조정한다.)

4. 아미노산류

항목	규격	시험방법
성상	고유의 색택과 향미를 가지며 이미․이취가 없어야 함	-
아미노산류 (㎎)	표시량의 80.0% ~ 180.0%	제2. 1. 3). (2)
수분(%)	10.0 이하 (건조제품에 한함, 수화물 무기질을 사용한 경우 수분함유부분을 제외하여 계산)	제2. 1. 1)
세균수	1㎖당 100 이하 (액상제품에 한함)	제2. 7. 2)
대장균군	음성	제2. 7. 5)

5. 자라분말

항목		규격		시험방법
		자라분말	자라분말제품
성상		고유의 색택과 향미를 가지며 이미․이취가 없어야 함		-
히드록시프롤린(%)		표시량 이상		제2. 1. 3). (2)
조단백질 (%)	동결건조품	48.0～58.0	14.0 이상	제2. 1. 3). (1)
	열풍건조품	50.0～70.0	15.0 이상
회분 (%)	동결건조품	16.0～40.0	4.8 이상	제2. 1. 2)
	열풍건조품	20.0～40.0	6.0 이상
수분(%)		5.0 이하	10.0 이하	제2. 1. 1)
대장균군		음성		제2. 7. 5)

Ⅱ. 지질류

1. 감마리놀렌산

항목	규격	시험방법
성상	고유의 색택과 향미를 가지며 이미․이취가 없어야 함	-
감마리놀렌산	표시량의 80.0~120.0%	제2. 1. 4). (4) (다만, 표준품은 감마리놀렌산을 사용)
리놀렌산(%) (달맞이 꽃 종자에 한한다)	57.0 이상 (달맞이꽃 종자가 100%일 때 57.0이상이며 달맞이꽃 종자의 함유량에 따라 환산하여 적용)	제2. 1. 4). (4) (다만, 표준품은 리놀렌산을 사용)
산가	1.0 이하 (단, 레시틴, 밀랍 첨가 시 5.0 이하)	제2. 1. 4). (3). ①
과산화물가 (meq/㎏)	10.0 이하 (단, 레시틴, 밀랍 첨가 시 15.0 이하)	제2. 1. 4). (3). ③
대장균군	음성	제2. 7. 5)
잔류용매	헥산

2. 레시틴

항목	규격		시험방법
	대두레시틴식품	난황레시틴식품
성상	고유의 색택과 향미를 가지며 이미․이취가 없어야 함		-
인지질(%)	표시량 이상 (아세톤불용물로서)		인지질
인지질 중 포스파티딜콜린의 함량(%)	10.0 이상	60.0 이상	인지질 중 포스파티딜콜린의 함량
콜레스테롤(%)	표시량 이하		제2. 1. 4). (5)
수분(%)	10.0 이하 (단, 액상제품은 제외)		제2. 1. 1)
산가	21.5 이하 (레시틴의 양이 60.0%일 때 21.5이하이며, 레시틴의 배합량에 따라 환산 적용)		제2. 1. 4). (3). ①
과산화물가	15.0 이하		제2. 1. 4. (3). ③
대장균군	음성		제2. 7. 5)

(1) 인지질(아세톤불용물로서)

① 시험용액의 조제

- 시험용 검체의 조제

검체(W1) (수분을 함유한 경우 미리 80℃ 전후로 가온하여 감압 조건에서 탈수 건조한다.)를 석유에테르, 헥산 등으로 용해한 후 여과하여 지질 이외의 성분은 제거하고, 이 여과액을 환저플라스크에 넣어 잔존하는 용제를 감압 조건에서 제거한 후 시험용 검체(W2)로 한다.

주1. 지질이외의 성분이 완전히 제거되도록 조작한다. 대두레시틴 이외의 원료를 제거하기 위해 클로로포름/메탄올 혼합액, 클로로포름/헥산 혼합액 등의 용제를 사용하는 것이 좋은 경우 또는 환류를 행한 경우가 좋은 경우가 있다.

주2. 캅셀제품에서 내용물이 균일하지 않은 것에 대해서는 캅셀기제 접착부위에 따라 중앙을 절단한 후 삼각플라스크에 넣고 에틸에테르 약 40㎖를 넣어 10분간 진탕시켜 내용물을 완전히 용해 추출시킨다. 추출액을 따라내어 모으고 다시 에틸에테르 40㎖를 넣어 5분간 진탕시킨 후, 캅셀기제를 제거하고 추출액을 앞의 추출액에 합하고 수욕 중 감압 조건하에서 용제를 완전히 날려 보낸 것을 분석 검체(W1)로 한다.

② 시험조작

- 정량시험

시험용검체(W2) 2g을 50㎖ 눈금의 공전원심분리관에 넣어 석유에테르 3㎖에 녹여 아세톤 15㎖를 가해 잘 혼합하고 얼음물 중에 15 분간 방치한다. 이에 미리 0~5℃로 냉각한 아세톤을 가해 50㎖로 하여 다시 얼음물중에 15분간 방치한 다음 3,000rpm에서 10분간 원심분리하여 상층액을 미리 무게를 구한 플라스크에 취한다. 또 공전원심간의 침전물에 0~5℃의 아세톤을 가해 50㎖로 하고, 얼음물 중에서 냉각시키면서 잘 혼합한 후 앞에서와 동일하게 원심 분리하여 상층액을 먼저 플라스크에 합하여 수욕상에서 증류하고 잔류물은 105℃에서 1시간 건조 후 항량으로 무게를 단다.(W3)

[계산식]

[eqn: rm 인지질 함량(%)＝{ W sub2 —W sub3 } over { W sub1 } ×100]

W1 : 검체 채취량(g)

W2 : 시험용 검체 채취량(g)

W3 : 아세톤 가용물 중량(g)

(2) 인지질 중 포스파티딜콜린의 함량

① 표준용액의 조제

- 표준인산용액 : 1.0982g의 인산2수소칼륨(KH2PO4)을 물에 용해하여250㎖로 하고 이 용액 5.0㎖를 1,000㎖로 희석하고, 검량선 작성용 표준인산용액으로 한다(인으로서 5.0㎍/㎖).

- 몰리브덴산암모늄용액 : 7 몰리브덴산(6-) 암모늄염4수화물 6g과 타트라산 칼륨 0.24g을 물 300㎖에 녹이고, 이에 황산(2+1) 120㎖를 가한 후 아마이드 황산암모늄 5g을 녹인 후 물을 가해 500㎖로 한다.

② 시험조작

- 인지질의 분리

검체 0.2~0.5g을 정확히 달아 헥산에 녹여 50㎖로 하여 시험용액으로 한다. 이중 100㎕를 취하여 박층판의 우하단 및 우변에서 2㎝위치에 점적하여 클로로포름 : 메탄올 : 7N 암모니아수(130 : 60 : 8, v/v/v)의 혼합액을 전개용매로 하여 2차 전개시킨다. 전개 후 박층판을 건조하고 요오드 증기를 사용하여 인지질의 반점을 발색시켜 포스파티딜콜린의 반점을 확인한다.

- 포스파티딜콜린 중 인의 정량

박층판에서 포스파티딜콜린의 반점을 긁어 100㎖의 원추형플라스크   에 취하고, 과염소산 2㎖ 및 질산 2~3방울을 가하고 시계접시로 뚜   껑을 덮개로 하여 가열분해한다. 식힌 후 비커 및 시계접시를 물로 씻어 여과한다. 여액 및 세액을 합하여 물로 50㎖가 되게 한다. 인으로서 1~10㎍을 함유하는 일정량을 100㎖ 분액여두에 정확히 취한 후, 4% 수산화나트륨용액으로 중화한다(지시약 : 0.1% P-니트로페놀 용액). 물로 전체량을 약 40㎖로 하고 몰리브덴산 암모늄용액 5㎖를 가해 진탕혼합하고 이어 1% 아스코르빈산용액 1㎖를 넣어 흔들어 혼합한 후 약 15분간 방치한다. 디이소부틸케톤 5㎖를 가해 5분간 진탕 혼합한다. 정치 후 용매층을 취해 파장 640㎚에서 디이소부틸케톤을 대조액으로 하여 흡광도를 측정한다. 별도로 작성한 검량선에서 인의 양을 구한다.

- 인지질 중 인의 정량

시험용액에서 100㎕를 비커에 취하고 헥산을 날려 보내고 ②와 동일한 조작으로 인지질의 인 함량을 구한다.

[계산식]

포스파티딜콜린 조성비(%)＝[eqn: rm { A} over { B}]×100

A : 포스파티딜콜린 중 인 함량(㎎/g)

B : 인지질 중 인 함량(㎎/g)

3. 배아유

항목	규격		시험방법
	배아유, 천연토코페롤강화배아유	배아유제품, 천연토코페롤강화배아유제품
성상	고유의 색택과 향미를 가지며 이미․이취가 없어야 함		-
리놀레산(%)	표시량 이상		제2. 1. 4). (4) (다만, 표준품은 리놀렌산을 사용한다.)
ɤ-오리자놀 (㎎/100g)	표시량 이상 (쌀배아유, 쌀배아유제품에 한함)		ɤ-오리자놀
토코페롤(%)	-배아유∶0.2～1.0 -천연토코페롤강화 배아유∶1.0～10.0	-배아유제품∶0.1 이상 -천연토코페롤강화 배아유제품∶0.5 이상	제2. 10. 2). (6)
산가	1.0 이하	1.0 이하 (단, 레시틴 또는 밀랍을 함유한 경우 5.0 이하)	제2. 1. 4). (3). ①
과산화물가	15.0 이하		제2. 1. 4). (3). ③
대장균군	음성		제2. 7. 5)

1) ɤ-오리자놀

① 고속액체크로마토그라피에 의한 정량

- 칼럼 : Nucleosil C18(내경 4.6㎜, 길이 250㎜)또는 이와 동등한 것

- 이동상 : 클로로포름:메탄올(1:4)

- 유속 : 0.7㎖/min

- 검출기 : UV 315㎚

- 클로로포름 : 고속액체크로마토그래피 분석용

- 메탄올 : 고속액체크로마토그래피 분석용

- 무수황산나트륨 : 무수황산나트륨(시약특급)을 120℃에서 2시간이상 가열시킨 후 데시케이터(실리카겔)에서 방냉하고 밀폐하여 보존한다.

- ɤ-오리자놀 : 순도 98%이상의 표준품

② 표준용액의 조제

ɤ-오리자놀을 클로로포름․메탄올(1:4)로 녹여서 10, 20, 30, 40, 50㎍/㎖ 함유의 표준용액을 각각 조제한다.

③ 시험용액의 조제

검체 약 2g을 정밀히 달아 삼각플라스크에 넣고 클로로포름․메탄올(2:1) 60㎖를 가하고 환류 냉각기를 부착하여 용액이 가볍게 끓을 정도까지 가온(약 60℃의 탕욕)하여 1시간동안 환류 추출한다. 추출액을 실온으로 방냉한 후 여과지(No.5A)로 여과하여 여과액을 얻는다.

여과지 위의 잔류물을 클로로포름․메탄올(2:1)로 씻어서 얻은 세액을 여과액에 합한다.

여과액을 무수황산나트륨으로 탈수한 후 용매를 제거하여 얻은 잔류물에 클로로포름․메탄올(1:4)을 가하여 정확히 200㎖로 한다.

이 용액을 0.50㎛의 멤브레인 필터로 여과하여 얻은 여과액을 시험용액으로 한다.

④ 시험조작

상기의 고속액체크로마토그래피 조건에서 표준용액, 시험용액 각각 20㎕씩을 주입하여 크로마토그램을 얻는다.

[계산식]

검량선에서 얻은 시험용액 1㎖ 중의 ɤ-오리자놀량(S μg)을 다음 식을 이용하여 시료 100g중의 ɤ-오리자놀량을 구한다.

ɤ-오리자놀량(mg/100g) = S×[eqn: { 200} over {1000 } × { 100} over { 검체채취량(g)}]

4. 뱀장어유

항목	규격	시험방법
성상	고유의 색택과 향미를 가지며 이미․이취가 없어야 함	-
에이코사펜타엔산 (EPA, %)	표시량 이상	제2. 1. 4). (4)
도코사헥사엔산 (DHA, %)	표시량 이상	제2. 1. 4). (4)
산가	1.0 이하	제2. 1. 4). (3). ①
과산화물가	15.0 이하	제2. 1. 4). (3). ③
요오드가	90～110	제2. 1. 4). (3). ②
대장균군	음성	제2. 7. 5)

5. 식물스테롤/식물스테롤에스테르

항목	규격	시험방법
성상	고유의 색택과 향미를 가지며 이미․이취가 없어야 함	-
식물스테롤 함량(㎎)	표시량의 80.0% ~ 120.0%	식물스테롤 함량
산가	2.0 이하	제2. 1. 4). (3). ①
수분(%)	1.0 이하 (액상제품은 제외)	제2. 1. 1)
세균수	1㎖당 100 이하 (액상제품에 한함)	제2. 7. 2)
대장균군	음성	제2. 7. 5)

1) 식물스테롤 함량

① 가스크로마토그래피(GC) 조건

- 칼럼 : 디메틸폴리실록산(100% dimethylpolysiloxane)을 충전한 칼럼(50m×0.32㎜×0.52㎛) 또는 이와 동등 이상인 것

- 검출기 : 수소염이온화검출기(FID)

- 주입구 온도 : 270℃

- 검출기 온도 : 320℃

- 칼럼 온도 : 초기온도 200℃(1분), 승온 5℃/min, 최종온도 300℃(14분)

- 캐리어가스 및 유량 : 질소(N2), 1㎖/min

- 주입량 : 1㎕

② 표준용액의 조제

베타-시토스테롤, 브라시카스테롤, 스티그마스테롤, 캄페스테롤 표준품 25㎎을 각각 정밀하게 달아 내부표준용액 25㎖에 녹여 표준용액으로 한다(1㎎/㎖).

- 내부표준용액 : 디히드로콜레스테롤(dihydrocholesterol)을 클로로포름에 녹여 농도가 5㎎/㎖이 되도록 한다.

③ 시험용액의 조제

베타-시토스테롤, 브라시카스테롤, 스티그마스테롤, 캄페스테롤의 합계량으로서 25㎎~100㎎이 함유되도록 적당량의 검체를 환저플라스크에 정밀하게 달아 에탄올 40㎖와 0.1N 에탄올성 수산화칼륨 용액 10㎖를 넣고 1시간 동안 검화시킨다. 검화 후 냉각하고 염화나트륨 포화용액 50㎖를 넣어 잘 혼합한 후 분액여두로 옮겨 헥산 100㎖씩으로 4회 추출한다. 이 헥산층을 감압 농축시킨 다음 내부표준용액 25㎖를 넣은 후 가스크로마토그래피 분석에 적합하도록 여과한다.

④ 시험조작

- 정량시험

표준용액과 시험용액을 각각 1㎕씩 주입하여 앞의 조건에서 시험한다. 상대머무름시간(Relative Retention Time, 내부표준물질에 대한 각 식물스테롤들의 머무름 시간의 비)를 사용하여 각 식물스테롤을 확인한다. 각 식물스테롤의 피크면적과 내부표준물질의 피크면적을 구하여 다음 식으로부터 개별 식물스테롤 함량을 구하고, 개별 식물스테롤의 함량을 합하여 식물스테롤의 함량을 구한다.

[계산식]

[eqn: rm 개별식물스테롤~함량(%)=C×{Psa}over{Pst}×{Pstis}over{Psais}×{V}over{W}×{1}over{10}]

C : 표준용액의 농도(㎎/㎖)

Psa : 시험용액 중 식물스테롤의 피크 면적

Pst : 표준용액 중 식물스테롤의 피크면적

Pstis : 표준용액 중 내부표준물질의 피크 면적

Psais : 시험용액 중 내부표준물질의 피크 면적

V : 시험용액의 전량(㎖)

W : 검체량(g)

식물스테롤 함량(%) = 베타-시토스테롤(%)+브라시카스테롤(%)+스티그마스테롤(%)+캄페스테롤(%)

6. 스쿠알렌

항목	규격		시험방법
	스쿠알렌	스쿠알렌 함유제품
성상	고유의 색택과 향미를 가지며 이미․이취가 없어야 함		-
스쿠알렌성분 (%)	표시량 이상		스쿠알렌성분
산가	1.0 이하	1.0 이하 (레시틴 또는 밀랍을 첨가시 5.0 이하)	제2. 1. 4). (3). ①
과산화물가	15.0 이하		제2. 1. 4). (3). ③
요오드가	360～380	—	제2. 1. 4). (3). ②
굴절률(20℃)	1.495～1.500	—	제2. 1. 4). (2). ②
비중 (20℃/20℃)	0.855～0.865	—	제2. 1. 4). (2). ①
대장균군	음성		제2. 7. 5)

1) 스쿠알렌성분

① 가스크로마토그래피 조건

- 칼럼 : 3.0% Silicon SE-30을 크로모솔브 W(AW/DMCS) 60~80메쉬에 코팅한 것(3㎜×2m)

- 검출기 : FID(수소염이온화형 검출기)

- 가스유출속도 : 30~60㎖/min

- 주입부 온도 : 300~310℃

- 칼럼온도 : 260~270℃

- 검출기온도 : 300~310℃

② 표준용액의 조제

스쿠알렌표준품 약 50㎎을 정밀히 달아 내부표준용액을 넣고 소량의 헥산으로 녹인 다음 헥산으로 정밀히 50㎖로 한 것을 표준원액(1,000ppm)으로 하여, 필요시 희석하여 사용한다.

- 내부표준용액의 조제

콜레스테롤 200mg을 정밀히 달아 클로로포름으로 녹여 정확히 200㎖가 되게 한 것을 내부표준용액으로 한다.

③ 시험용액의 조제

검체 50㎎을 정밀히 달아 내부 표준용액과 헥산을 넣어 녹이고 정확히 50㎖가 되게 하여 시험용액으로 한다. 필요한 경우 원심분리 또는 여과하여 사용한다.

④ 시험조작

- 정량시험

검액 및 표준액 각각 1~5㎕씩을 가스크로마토그래피내에 주입하여 크로마토그램을 얻은 후, 피크의 유지시간을 비교하여 정성시험을 행한다. 또한 내부표준법에 따라 함량을 구한다.

7. 알콕시글리세롤

항목	규격	시험방법
성상	고유의 색택과 향미를 가지며 이미․이취가 없어야 함	-
알콕시글리세롤 (%)	표시량 이상	알콕시글리세롤
산가	1.0 이하	제2 .1. 4). (3). ①
과산화물가	15.0 이하	제2 .1. 4). (3). ③
대장균군	음성	제2. 7. 5)

1) 알콕시글리세롤

① 박층크로마토그래피 조건

- 흡착제 : 실리카겔 60F 254

- 전개용매 : 헥산․초산에틸․에탄올(10:8:1)

- 점적량 : 2㎕

- 발색제 : 0.1% 로다민B 에탄올용액

② 시험조작

검체 5g을 환류냉각기를 장치하여 100℃에서 에탄올성 1N 수산화나트륨용액 50㎖를 가하여 1시간 30분 동안 혼합한 후 에탄올을 증발시키고 열수를 가한 다음 에테르로 수회 세척하여 에테르층을 합한다. 알콕시글리세롤을 함유한 비비누화성분은 에테르층으로 이행한다. 이 에테르층에 물 30㎖를 가해 교반 후 물층을 제거한다. 이 조작을 물층이 페놀프탈레인 시액으로 붉은 색이 나타나지 않을 때까지 반복한 후 에테르층을 무수황산나트륨으로 탈수시켜 증발건조한 후 중량을 칭량하여 비비누화량으로 한다. 비비누화 중의 스쿠알렌량(토코페롤을 첨가한 경우 토코페롤량 포함)을 식품공전에 따라 측정한 후, 다음 식에 의해 알콕시글리세롤의 함량을 구한다. 별도로 앞의 비비누화물을 한 위치에서 반점이 확인되어야 한다.

[계산식]

알콕시글리세롤의 함량(%)

=[eqn: rm { "비비누화의 양(g)—스쿠알렌의 양"} over { 검체채취량(g)} ×100]

단, 토코페롤 첨가제품은 토코페롤양을 추가로 빼준다.

8. 옥타코사놀

항목	규격		시험방법
	옥타코사놀	옥타코사놀함유제품
성상	고유의 색택과 향미를 가지며 이미․이취가 없어야 함		-
옥타코사놀 성분(%)	표시량 이상		옥타코사놀 성분
수분(%)	10.0 이하 (단, 액상제품은 제외한다)		제2. 1. 1)
산가	1.0 이하 (조지방함량 20.0% 이상인 것에 한함)	1.0 이하 (조지방함량 20.0% 이상인 것에 한함. 다만, 레시틴, 밀랍을 함유하는 경우 5.0이하)	제2. 1. 4). (3). ①
과산화물가	15.0 이하 (조지방함량 20.0% 이상인 것에 한함)		제2. 1. 4). (3). ③
대장균군	음성		제2. 7. 5)

1) 옥타코사놀 성분

① 가스크로마토그래피 조건

- 칼럼 : 3% Silicon OV-17을 크로모솔브 W(HP) 60~80메쉬에 코팅한 것(3㎜×1m)

- 검출기 : FID(수소염이온화형 검출기)

- 가스유량속도 : 60㎖/min

- 주입부 온도 : 100~330℃, 10℃/min 승온조작

- 칼럼온도 : 360℃

- 검출기온도 : 360℃

② 표준용액의 조제

옥타코사놀 표준품 25㎎을 정확히 취하여 에테르에 녹여 50㎖로 한다.

③ 시험용액의 조제

검체 약 5g을 비누화용 플라스크에 정확히 취해서 1N 에탄올․수산화칼륨액 50㎖를 넣고 냉각기를 부착하여 수욕상 또는 열판에서 자주 흔들어주면서 천천히 가열하여 1시간동안 비등 비누화시킨다.

비누화가 끝나면 가열을 중지하고 소량의 온수로 냉각기를 씻어 내리고 냉각기를 떼어낸 후 온수 100㎖로 비누화용 플라스크를 씻으면서 비누화액을 분액여두에 옮기고 물 50㎖를 가하여 혼합한 후 상온으로 식힌다. 다음 에테르 100㎖로 비누화용 플라스크를 씻어서 분액여두에 넣고 마개를 한 후 처음 몇 번 흔들어 마개를 열어 생성된 에테르 가스를 배출시키고 다시 마개를 한 후 1분간 격렬히 진탕한 후 두 층으로 확실히 분리될 때까지 방치한다. 분리된 하층은 제2의 분액여두에 옮겨 그것에 에테르 50㎖를 넣고 제1의 분액여두와 동일하게 조작하여 분리된 하층은 제3의 분액여두에 옮겨 그것에 에테르 50㎖를 넣고 제1의 분액여두와 동일하게 조작 후 하층은 버리고 제2, 제3의 분액여두의 에테르는 제1의 분액여두에 옮긴다. 에테르 소량씩으로 분액여두를 수회 씻어 합한다.

이에 물 30㎖씩을 가하여 흔들어 충분히 방치하여 씻은 액이 페놀프탈레인 시액으로 착색이 되지 않을 때까지 씻어준다. 에테르층은 무수황산나트륨을 사용 탈수한 후 500㎖ 증류플라스크에 옮기고, 수기 등은 에테르로 씻어 합한다. 에테르의 대부분을 증류시킨 후 아세톤으로 증류플라스크의 내면을 충분히 씻어 50㎖로 하여 시험용액으로 한다.

④ 시험조작

-정량시험

검액 및 표준액 각각 1~5㎕씩을 가스크로마토그래프내에 주입하여 구성하고 있는 옥타코사놀의 크로마토그램을 얻은 후 표준그래프와 비교하여 해당하는 피크를 확인한다.

피크의 면적 또는 높이 비교로 옥타코사놀의 함량(%)을 계산한다.

9. 에이코사펜타엔산(EPA)/도코사헥사엔산(DHA)

항목	규격	시험방법
성상	고유의 색택과 향미를 가지며 이미․이취가 없어야 함	-
에이코사펜타엔산(EPA, %) 또는 도코사헥사엔산(DHA, %)	표시량의 80.0 ~ 120.0	제2. 1. 4). (4) (다만, 표준품은 EPA, DHA로 함)
산가	1.0 이하 (단, 레시틴, 밀랍을 첨가한 경우 5.0 이하)	제2. 1. 4). (3). ①
과산화물가	15.0 이하	제2. 1. 4). (3). ③
대장균군	음성	제2. 7. 5)

10. 자라유

항목	규격	시험방법
성상	고유의 색택과 향미를 가지며 이미․이취가 없어야 함	-
팔밑올레산(%)	8.0～18.0	제2. 1. 4). (4) (다만, 표준품은 팔밑올레산으로 함)
아라키돈산(%) + 에이코사펜타엔산(%)	2.0～8.0	제2. 1. 4). (4) (다만, 표준품은 아라키돈산을 추가)
조지방(%)	95.0 이상	제2. 1. 4). (1)
산가	1.0 이하	제2. 1. 4). (3). ①
과산화물가	15.0 이하	제2. 1. 4). (3). ③
대장균군	음성	제2. 7. 5)

11. 지방산류

항목	규격	시험방법
성상	고유의 색택과 향미를 가지며 이미․이취가 없어야 함	-
지방산류(g)	표시량의 80.0% ～ 120.0%	제2. 1. 4). (4)
수분(%)	10.0 이하 (건조제품에 한함)	제2. 1. 1)
세균수	1㎖당 100 이하 (액상제품에 한함)	제2. 7. 2)
대장균군	음성	제2. 7. 5)

12. 포도씨유

항목	규격	시험방법
성상	고유의 색택과 향미를 가지며 이미․이취가 없어야 함	-
리놀레산(%)	표시량의 80.0% ～ 120.0%	제2. 1. 4). (4)
카테친(mg/100g)	표시량 이상	제2. 1. 1)
산가	1.0 이하	제2. 1. 4). (3)
과산화물가	15.0 이하	제2. 1. 4). (3)
대장균군	음성	제2. 7. 5)

1) 카테친(바닐린비색법)

① 분광광도계(Spectrophotometer)

- 발색용액 : 바닐린 1g을 메탄올 100㎖에 용해시킨다. 따로 메탄올의 8%가 되도록 진한 염산을 혼합하여 시험전에 바닐린용액과 염산용액을 1:1로 혼합한 것을 발색시약으로 한다.

② 표준용액의 조제

카테틴 표준품을 메탄올에 녹여 10㎍/㎖로 한 것을 표준용액으로 한다.

③ 시험용액의 조제

검체 약 200mg을 정확히 달아 캡튜브에 넣고 메탄올 10㎖를 가하여 20분간 잘 혼합시킨 다음 3,000rpm에서 10분간 원심분리하여 상등액을 시험용액으로 한다.

④ 시험조작

표준용액과 시험용액을 각각 1㎖씩 취해 발색시약 5㎖를 넣고 30℃에서 20분간 반응시킨다. 반응이 끝난 후 500nm에서 흡광도를 측정하여 검량선을 작성한 후 시험용액 중의 카텐친 농도(㎍/g)를 구한 다음 다음식에 의해 검체 중의 카테친 함량(mg/100g)을 구한다.

[계산식]

VXN     10

카테틴함량(mg/100g) = C X --------- X -----

W     100

C : 시험용액 중 카텐친의 농도(㎍/g)

W : 검채채취량(g)

V : 시험용액 전량(㎖)

N : 시험용액의 희석배수

Ⅲ. 탄수화물류

1. 글루코사민

항목	규격		시험방법
	글루코사민분말	글루코사민함유제품
성상	고유의 색택과 향미를 가지며 이미․이취가 없어야 함		-
글루코사민(%)	표시량 이상		글루코사민
수분(%)	1.0 이하	10.0 이하 (다만, 액상제품은 제외)	제2. 1. 1)
납(mg/kg)	2.0 이하		제2. 5. 3). (2)
대장균군	음성		제2. 7. 5)

1) 글루코사민

검체 0.5g(글루코사민으로)을 정밀히 취하여 필요한 경우 탈지하고 물 50㎖를 가하여 녹인 후 아세토니트릴로 100㎖로 정용한 후 제3장. 건강기능식품별 시험방법 Ⅲ. 탄수화물류 4. 키토올리고당 1) 키토올리고당 (2)유리 D-글루코사민 시험방법에 따라 시험한다.

2. 뮤코다당․단백

항목	규격	시험방법
성상	고유의 색택과 향미를 가지며 이미․이취가 없어야 함	-
뮤코다당․단백질(%)	표시량 이상	뮤코다당․단백질
단백질과 콘드로이친황산의 비율 (단백질/콘드로이친황산)	3.0 이상 9.0 미만	뮤코다당․단백질
콘드로이친황산	확인	콘드로이친황산확인시험
수분(%)	8.0 이하 (다만, 뮤코다당․단백제품중 액상제품, 연질캅셀제품은 제외)	제2. 1. 1)
살모넬라	음성	제2. 7. 13)
대장균군	음성	제2. 7. 5)

1) 뮤코다당․단백질 및 비율 시험

(1) 콘드로이친황산

[시약조제]

- 글루쿠론산 표준용액 : δ-글루쿠로노락 톤(표준품) 약 0.04g을 정확히 달아 물을 가해 용해하여 100㎖로 한다. 이 액 1㎖를 정확히 취하여 물을 가해 20㎖로 한다.

- 카바졸시액 : 카바졸(C12H9N<1급>) 0.125g에 무수에탄올 100㎖를 가해 용해한다(냉암소에 보관).

- 붕산나트륨황산시액 : 붕산나트륨(특급) 1.0g에 정밀분석용 황산을 가해 200㎖로 한다.

[시험방법]

- 정량조작

검체 약 10g을 수분이 흡수되지 않도록 빨리 분쇄 혼합하고 0.3g을 정밀히 달아 물을 가하여 혼합한 것을 정확히 100㎖로 한다. 이 액 4㎖를 정확히 취하여 물을 가해 정확히 20㎖로 하고 정량분석용 여지(5종 C)를 사용하여 여과한 것을 검액으로 한다.

별도 두 개의 비색관에 붕산나트륨 황산시액 5㎖씩을 정밀히 달아 취하여 얼음물로 충분히 냉각한다.

각각의 검액과 표준용액을 정확히 1㎖씩을 취해 시액위에 주의하여 가하고 냉각하면서 혼합하고, 수욕상에서 10분간 가열한 후 즉시 얼음물로 냉각한다. 각각에 카바졸시액 0.2㎖를 정확히 가하여 혼합하고 수욕상에서 15분간 가열하고 얼음물로 실온까지 냉각한다. 이들의 액에 대하여 물 1.0㎖를 사용하여 동일하게 조작한 것을 대조액으로 하여, 파장 530㎚에서 흡광도를 분광광도계로 측정하고 다음 식에 따라 콘드로이친황산의 함량을 구한다.

[계산식]

콘드로이친황산의 함량 = 글루쿠론산(%) × 2.593

[eqn: 글루쿠론산(%)=rm {{{검액의흡광도}over{표준용액의" "흡광도}×"표준품(g)"×1.1023} over { 검체채취량(g)}}×100]

여기서 2.593 : 콘드로이친황산의 분자량/글루쿠론산의 분자량

1.1023 : 글루쿠론산의 분자량/δ-글루쿠로노락톤의 분자량

(2) 단백질

검체 약 10g을 수분이 흡수되지 않도록 빨리 분쇄하여 혼합하고 약 30㎎을 정확히 달아 제2장 일반시험법 1. 일반성분시험법 3) 질소화합물 (1) 총질소 및 조단백질 ① 세미마이크로 킬달법에 따라 질소함량을 측정하여 다음 식에 따라 단백질 함량을 구한다.

[계산식]

단백질(%) = 질소함량(%) × 5.56(질소계수)

상기 질소환산계수 5.56은 원료중에 함유되어 있는 젤라틴단백질(질소함량 18%)을 근거로 구했다. 뮤코다당․단백 함량은 ① 및 ②에서 구한 콘드로이친황산과 단백질 함량의 합계로 구한다.

2) 콘드로이친황산의 확인시험(전기영동)

[장치 및 시험조건]

- 전기영동장치 : 직류발생장치 및 영동조

- 담체 : 셀룰로오스 아세테이트막

[시약조제]

- 검액의 조제

검체 약 10g을 분쇄혼합 또는 균질화 한 후 그 중 4.0g을 달아 물 200㎖를 가하여 잘 혼합한 후 1N 수산화나트륨액을 이용하여 pH를 7.0~8.0으로 하여 프로나제(시약용) 100mg을 가하여 50~55℃에서 3시간 소화한다. 소화액을 수욕중에서 10분간 가열한 후 냉각하여 정량 분석용 여지(5종 C)로 여과하여 여과액을 검액으로 한다.

- 전기영동용매 : 1M 초산-피리딘(pH 3.5)

- 콘드로이친황산 표준용액 : 콘드로이친황산 A나트륨염 100mg을 달아 물 100㎖를 가하여 용해한다.

- 발색제 : 톨루이딘(시약용) 1g을 달아 3% 초산용액 200㎖를 가하여 용해한다.

- 세정제 : 1% 초산용액

[시험방법]

① 영동 : 5㎝의 셀룰로오스 아세테이트의 단(끝)에서 1㎝의 위치에 0.5㎝ 폭 간격으로 검액 및 표준용액을 각각 1㎕씩을 점적하고 단(끝)에서 1㎝ 스포트 점의 정도를 음극치로 하며 영동용매의 증기로 포화한 영동조 내에서 0.5㎃/㎝, 20분간 영동한다.

② 염색 : 영동을 끝낸 셀룰로오스 아세테이트막을 꺼내어 염색제에 5분간 담근 후 1% 초산용액으로 1회 씻고 다음에 물로 2회 씻는다.

③ 동정 : 콘드로이친황산의 표준물질과 동일한 위치에 적자색의 밴드(띠)를 확인한다.

3. 식이섬유류

항목	규격	시험방법
성상	고유의 색택과 향미를 가지며 이미․이취가 없어야 함	-
식이섬유(g)	표시량의 80.0% ～ 120.0%	제2. 1. 5). (3)
수분(%)	10.0 이하 (건조제품에 한함)	제2. 1. 1)
세균수	1㎖당 100 이하 (액상제품에 한함)	제2. 7. 2)
대장균군	음성	제2. 7. 5)

4. 키토올리고당

항목	규격	시험방법
성상	고유의 색택과 향미를 가지며 이미․이취가 없어야 함	-
키토올리고당(%)	표시량의 80.0~120.0%	키토올리고당
수분(%)	10.0 이하 (다만 액상제품은 제외)	제2. 1. 1)
납(㎎/㎏)	2.0 이하	제2. 5. 3). (2)
대장균군	음성	제2. 7. 5

1) 키토올리고당

(1) 총글루코사민

① 시험용액의 조제

검체 0.04g(글루코사민으로)을 정밀히 취하여 필요한 경우 탈지하고 물에 녹여 액성이 산성인 경우 중화(pH7.0)시켜 물을 가하여 100㎖로 하여 3,000rpm에서 10분간 원심분리한 후 상층액을 검액으로 한다.

[시험법]

제3장. 건강기능식품별 시험법 Ⅲ. 탄수화물류 5. 키토산 1) 키토산 ② 시험조작에 따라 시험한다.

(2) 유리 D-글루코사민

① 고속액체크로마토그래피 조건

- 칼럼 : 길이 250㎜, 안지름 4.6㎜의 NH2-60칼럼, 또는 이와 동등한 것

- 검출기 : 시차굴절계(RI)

- 이동상 : 물 : 아세토니트릴(25:75)

- 유 속 : 0.8㎖/min

- 칼럼온도 : 40℃

② 표준용액의 조제

D-글루코사민 표준품 0.5g을 100㎖용 메스플라스크에 정밀히 달아 물 50㎖를 가하여 녹인 후 아세토니트릴로 100㎖까지 채운다.

③ 시험용액의 조제

검체 약 5g을 메스플라스크에 정밀히 달아 물 25㎖를 가하여 녹인 후 아세토니트릴로 50㎖까지 채운다. 이를 0.45㎛의 멤브레인 필터로 여과한 것을 시험용액으로 한다.

④ 시험조건

- 정량시험

시험용액 및 표준용액을 각각 10㎕ 씩 주입하여 얻은 피크의 넓이 또는 높이를 구하여 검량선을 작성한 후 시험용액의 글루코사민의 농도(㎍/㎖)를 구하고, 다음의 식에 의해 검체 중 글루코사민의 함량(g/100g)을 산출한다.

[eqn: rm 글루코사민~함량(g/100g)=S×{a×b}over{검체의채취량(g)}×{100}over{1,000,000}]

S : 시험용액중의 당질의 농도(㎍/㎖)

a : 시험용액의 전량(㎖)

b : 희석배수

(3) 키토올리고당

키토올리고당 = 총 글루코사민 함량 - 유리 D-글루코사민 함량

5. 키토산

항목	규격	시험방법
성상	고유의 색택과 향미를 가지고 이미, 이취가 없어야 한다.	-
키토산(%)	표시량의 80.0~120.0%	키토산
수분(%)	10.0 이하 (다만, 액상제품은 제외)	제2. 1. 1)
납(㎎/㎏)	2.0 이하	제2. 5. 3). (2)
대장균군	음성	제2. 7. 5)

1) 키토산(글루코사민으로)

①시험용액의 조제

검체 0.04g(글루코사민으로)을 정밀히 취하여 필요한 경우 탈지하고 산성에서 검체를 모두 녹인 후 100㎖로 하여 검액으로 한다.

- 아세틸아세톤시액 : 증류 정제한 무색 아세틸아세톤(BP 138~140℃) 1.5㎖ 에 1.2N 탄산나트륨용액을 가하여 50㎖로 한다.

- p-디메틸아미노벤즈알데히드(p-Dimethylaminobenzaldehyde)시액

: p-디메틸아미노벤즈알데히드 1.6g에 염산 30㎖를 가하여 녹이고 96%(v/v) 에탄올 30㎖를 가하여 혼합한다.

② 시험조작

검액 10㎖를 취하여 염산 7㎖ 및 물을 가하여 20㎖로 하고, 이 액 5㎖를 시험관에 취하고 탈기 밀봉하여 105℃에서 24시간(또는 121℃에서 5시간, 130℃에서 3시간, 140℃에서 90분) 분해한 후 뚜껑을 열어 감압하에 염산 및 물을 제거한 다음 잔류물을 물 5㎖로 녹이고 불용물이 있으면 여과한다.

이 여액 1㎖를 마개있는 시험관에 취하고 아세틸 아세톤시액 2㎖ 를 가하여 혼합한 후 96℃에서 1시간 가열한 후 흐르는 물에서 냉각시키고 이에 96%(v/v) 에탄올 20㎖를 가하고 p-디메틸아미노벤즈알데히드시액 2㎖를 가하여 혼합하고 실온에서 2시간 방치 후 파장 530㎚에서 흡광도를 측정한다.

따로 D-글루코사민 또는 N-아세틸 D-글루코사민을 100~500μg(D-글루코사민으로)/㎖ 함유한 용액 10㎖를 취하여 앞에서의 ② 시험조작 이하에 따라 동일하게 조작하여 다음과 같이 총글루코사민의 함량을 구한다.

[계산식]

총글루코사민(%) =

[eqn: rm 표준용액의~농도(글루코사민으로,㎍/10㎖) TIMES {Sa} over {St} TIMES {10} over {검체의채취량(g)} TIMES {100} over {10 ^{6}}]

Sa : 검액의 흡광도

St : 표준용액의 흡광도

6. 프락토올리고당

항목	규격	시험방법
성상	고유의 색택과 향미를 가지며 이미․이취가 없어야 함	-
프락토올리고당 함량(%)	표시량의 80.0~120.0%	프락토올리고당
수분(%)	10.0이하 (단, 액상제품은 제외).	제2. 1. 1)
납(㎎/㎏)	1.0이하	제2. 5. 3). (2)
세균수	1㎖당 100이하	제2. 7. 2)
대장균군	음성	제2. 7. 5)

1) 프락토올리고당 함량

① 고속액체크로마토그래피(HPLC) 조건

- 칼럼 : 아미노칼럼, 당분석칼럼 또는 이와 동등 이상인 것

- 검출기 : 시차굴절계(RI)

- 유속 : 1.0㎖/min

- 이동상 : 아세토니트릴 : 물(65 : 35) (칼럼의 종류나 상태에 따라 조성을 달리 할 수 있다. 아세토니트릴과 물의 비율을 65 : 35에서 70 : 30정도의 차이로 조정한다. 소량의 에틸알코올을 넣어 조정할 수도 있다)

② 표준용액의 조제

1-케스토즈(GF2), 니스토즈(GF3), 1-F 프락토퓨라노실니스토즈(GF4)를 0.4g씩 달아 각각 20㎖의 용량플라스크에 넣고 약 10㎖의 물을 넣어 용해시킨 후 증류수로 표선까지 채운 것을 표준원액으로 한다. 표준원액 1, 2, 3, 4, 및 5㎖를 정확히 취하여 각각 10㎖의 용량플라스크에 옮겨 넣고, 이에 내부표준용액 1㎖를 넣은 뒤 물로 표선까지 채운 것을 표준용액으로 한다.

- 내부표준용액

글리세롤 5g을 달아 100㎖ 용량플라스크에 넣고 에탄올 50㎖를 넣어 용해시킨 후 물로 표선까지 채운 것을 내부표준용액으로 한다(글리세롤외에 아라비노스도 내부표준물질로서 사용할 수 있다).

③ 시험용액 조제

프락토올리고당으로서 0.2g∼2g이 함유되도록 적당량의 검체를 정밀하게 달아 100㎖의 용량플라스크에 넣고 이에 물 20㎖를 가하여 용해 또는 추출한다(산성인 채로 실험을 진행할 경우 가수분해의 우려가 있으므로 필요하면 중화하고, 가열하면서 혼합하든지 초음파처리를 한다). 용해되지 않는 물질이 거의 없을 때에는 내부표준용액 20㎖를 넣은 후 증류수로 표선까지 채운다. 필요하면 여과(No.5B 또는 10,000 Da cut off 원심분리필터)하여 사용한다. 얻어진 여과액에 동량의 에탄올을 첨가하여 희석한다. 침전 또는 탁한 것이 생겼을 경우에는 여과하고 여과액을 시험용액으로 한다.

주1. 용해되지 않는 물질이 많을 때에는 추출액을 여과(No.5B)하면서 100㎖ 용량플라스크에 전가용물을 옮겨 넣고 이하 똑같이 처리한다.

④ 시험조작

-정량시험

표준용액과 시험용액을 각각 10㎕씩 주입하여 앞의 조건에서 시험한다. 표준용액 중 각 프락토올리고당과 내부표준물질의 피크의 면적 또는 높이에 의해 구한 검량선을 사용하여 시험용액 중 각 프락토올리고당의 농도(㎎/㎖)를 구하고, 다음 식에 의하여 검체 중 프락토올리고당 (GF2＋GF3＋GF4)의 함량(%)을 구한다.

[계산식]

[eqn: rm 프락토올리고당~함량(%)=(A+B+C+)×d×{100}over{W}×{100}over{1,000}]

A : 시험용액 중 GF2의 농도(㎎/㎖)

B : 시험용액 중 GF3의 농도(㎎/㎖)

C : 시험용액 중 GF4의 농도(㎎/㎖)

d : 희석배수

W : 시료채취량(g)

Ⅳ. 비타민류

1. 베타카로틴

항목	규격	시험방법
성상	고유의 색택과 향미를 가지며 이미․이취가 없어야 함	-
베타카로틴 (㎎/g)	표시량의 80.0% ~ 150.0%	베타카로틴
총페오포르바이드 (㎎/100g)	80.0 이하 (단, 당근에서 추출한 베타카로틴은 제외).	제3. Ⅷ. 2. (3)
산가	5.0 이하 (조지방 함량 20.0%이상인 것에 한함)	제2. 1. 4). (3). ①
과산화물가	15.0 이하 (조지방 함량 20.0%이상인 것에 한함. 다만, 레시틴을 함유한 경우 30.0이하이어야 함)	제2. 1. 4). (3). ③
대장균군	음성	제2. 7. 5)

1) β-카로틴

① 고속액체크로마토그래피(HPLC) 조건

- 칼럼∶역상분배형(ODS-2, Partisol ODS′-3 또는 이와 동등한 것)

- 이동상∶아세토니트릴∶디클로로메탄∶메탄올(7∶3∶1)

- 유속∶0.5~1.0㎖/min

- 주입량∶20㎕

- 검출파장∶UV 450㎚

② 시험조작

제2. 일반시험법 10. 미량성분시험법 2) 비타민류 (1) 비타민 A ② 고속액체크로마토그래피에 의한 정량법에 따라 시험하여 n-헥산 또는 이소프로판올‧클로로포름(1∶1)용액으로 β-카로틴 5μg/㎖되게 한다. 필요한 경우 마이크로필터링 한다(여과지∶FH Type, pore size 0.5μm). 다음의 조건에 따라 분리‧정량한다. 검체가 유지를 함유하지 않는 경우에는 비누화과정을 생략할 수 있다.

[계산식]

β-카로틴의 함량(㎎/g)＝S×[eqn: rm { a×b} over { 검체채취량(g)}]

S∶시험용액 중의 β-카로틴 농도(㎎/g)

a∶시험용액의 양(㎖)

b∶희석배수(적용될 경우)

2. 비타민류

항목	규격	시험방법
성상	고유의 색택과 향미를 가지며 이미․이취가 없어야 함	-
비타민 A (μg RE)	표시량의 80.0% ～ 150.0%	제2. 10. 2). (1)
비타민 B1(mg)	표시량의 80.0% ～ 180.0% 단, 함량이 최대함량의 권장기준을 초과하는 제품인 경우 90.0% ～ 150.0%	제2. 10. 2). (2)
비타민 B2(mg)	80.0% ～ 180.0% 단, 함량이 최대함량의 권장기준을 초과하는 제품인 경우 90.0% ～ 150.0%	제2. 10. 2). (3)
비타민 B6(mg)	표시량의 80.0% ～ 180.0% 단, 함량이 최대함량의 권장기준을 초과하는 제품인 경우 90.0% ～ 150.0%	제2. 10. 2). (9) 혹은 제2. 10. 2). (10). ②
비타민 B12(μg)	표시량의 80.0% ~ 180.0% 단, 함량이 최대함량의 권장기준을 초과하는 제품인 경우 90.0% ～ 150.0%	제2. 10. 2). 10. ⑤
비타민 C(mg)	표시량의 80.0% ~ 180.0% 단, 함량이 최대함량의 권장기준을 초과하는 제품인 경우 90.0% ～ 150.0%	제2. 10 . 2). (4)
비타민 D(μg)	표시량의 80.0% ～ 150.0%	제2. 10. 2). (7)
비타민 E (mg α-TE)	표시량의 80.0% ～ 180.0% 단, 함량이 최대함량의 권장기준을 초과하는 제품인 경우 90.0% ～ 150.0%	제2. 10. 2). (6)
비타민 K(μg)	표시량의 80.0% ～ 180.0%	제2. 10. 2). (8)
나이아신 (mg NE)	표시량의 80.0% ～ 180.0% 단, 함량이 최대함량의 권장기준을 초과하는 제품인 경우 90.0% ～ 150.0%	제2. 10. 2). (5)
비오틴(μg)	표시량의 80.0% ～ 180.0% 단, 함량이 최대함량의 권장기준을 초과하는 제품인 경우 90.0% ～ 150.0%	제2. 10. 2). (10). ⑦
엽산(μg)	표시량의 80.0% ～ 180.0% 단, 함량이 최대함량의 권장기준을 초과하는 제품인 경우 90.0% ～ 150.0%	제2. 10. 2). (10). ③
판토텐산(mg)	표시량의 80.0% ～ 180.0% 단, 함량이 최대함량의 권장기준을 초과하는 제품인 경우 90.0% ～ 150.0%	제2. 10. 2). (10). ④
수분(%)	10.0 이하 (건조제품에 한함)	제2. 1. 1)
세균수	1㎖당 100이하 (액상제품에 한함)	제2. 7. 2)

Ⅴ. 무기질류

항목	규격	시험방법
성상	고유의 색택과 향미를 가지며 이미․이취가 없어야 함	-
구리(㎎)	표시량의 80.0% ~ 180.0% 단, 함량이 최대함량의 권장기준을 초과하는 제품인 경우 90.0% ～ 150.0%	제2. 5. 1). (3)에 따라 용액을 조제 후 제2. 5. 1). (1) 혹은 (3)
마그네슘(㎎)	표시량의 80.0% ~ 180.0% 단, 함량이 최대함량의 권장기준을 초과하는 제품인 경우 90.0% ～ 150.0%
망간(㎎)	표시량의 80.0% ~ 180.0% 단, 함량이 최대함량의 권장기준을 초과하는 제품인 경우 90.0% ～ 150.0%
몰리브덴(μg)	표시량의 80.0% ～ 180.0% 단, 함량이 최대함량의 권장기준을 초과하는 제품인 경우 90.0% ～ 150.0%
셀렌(㎍)	표시량의 80.0% ~ 180.0% 단, 함량이 최대함량의 권장기준을 초과하는 제품인 경우 90.0% ～ 150.0%
아연(㎎)	표시량의 80.0% ~ 180.0% 단, 함량이 최대함량의 권장기준을 초과하는 제품인 경우 90.0% ～ 150.0%	제2. 10. 1). (8)
요오드(㎍)	표시량의 80.0% ~ 180.0% 단, 함량이 최대함량의 권장기준을 초과하는 제품인 경우 90.0% ～ 150.0%	제2. 10. 1). (9)
철(㎎)	표시량의 80.0% ~ 180.0% 단, 함량이 최대함량의 권장기준을 초과하는 제품인 경우 90.0% ～ 150.0%	제2. 10. 1). (4)
칼륨(㎎)	표시량의 80.0% ~ 180.0%	제2. 10. 1). (7)
칼슘(㎎)	표시량의 80.0% ～ 180.0% 단, 최대함량의 권장기준을 초과하는 제품인 경우 90.0% ～ 150.0%	제2. 10. 1). (2)

항목	규격	시험방법
크롬(μg)	표시량의 80.0% ～ 180.0%	제2. 5. 1). (3)에 따라 용액을 조제 후 제2. 5. 2). (1) 혹은 (2)
수분(%)	10.0 이하 (건조제품에 한하며, 수화물(水化物)무기질을 사용한 경우 수분함유부분을 제외하여 계산)	제2. 1. 1)
납(㎎/㎏)	3.0 이하 (우골분, 패각분 등 소성칼슘을 사용한 제품에 한함)	제2. 5. 3). (2)
세균수	1㎖당 100 이하 (액상제품에 한함)	제2. 7. 2)
대장균군	음성	제2. 7. 5)

Ⅵ. 식물류

1. 녹차추출물

항목	규격	시험방법
성상	고유의 색택과 향미를 가지며 이미․이취가 없어야 함	-
카테킨 함량(mg)	표시량의 80.0 ~ 120.0%
카페인 함량(mg)	표시량 이하
수분(%)	5.0 이하 (단, 액상제품은 제외)	제2. 1. 1)
세균수	1㎖당 100 이하 (단, 액상제품에 한함)	제2. 7. 2)
대장균군	음성	·제2. 7. 5)

1) 카테킨 함량, 카페인 함량

① 고속액체크로마토그래피(HPLC) 조건

- 칼럼 : 옥타데실실릴화한실리카겔을 충전한 칼럼(ODS 칼럼, 4.6㎜×250㎜) 또는 이와 동등 이상의 것

- 검출기 및 파장 : 자외부검출기(UV) 280㎚

- 유속 : 1.0㎖/min

- 이동상 : A액 - 0.1% 초산용액, B액 - 아세토니트릴

시간(분)	A(%)	B(%)
0	85	15
10	85	15
15	70	30
20	50	50
21	85	15
30	85	15

② 표준용액의 조제

에피갈로카테킨(EGC), 에피갈로카테킨갈레이트(EGCG), 에피카테킨(EC), 에피카테킨갈레이트(ECG) 표준품 각각을 메탄올에 녹여 각각 표준원액(1,000㎍/㎖)을 만들고, 표준원액을 메탄올로 적당히 희석하여 표준용액을 만든다. 따로 카페인 표준품을 메탄올에 녹여 표준원액(1,000㎍/㎖)을 만들고, 표준원액을 메탄올로 적당히 희석하여 표준용액을 만든다.

③ 시험용액의 조제

에피갈로카테킨(EGC), 에피갈로카테킨갈레이트(EGCG), 에피카테킨(EC) 및 에피카테킨갈레이트(ECG)의 합계량으로서 20㎎~80㎎이 함유되도록 적당량의 검체를 용량플라스크에 정밀하게 달아 메탄올을 가하고 초음파를 이용하여 분산 또는 용해시켜 정확하게 100㎖로 한다. 이를 0.45㎛의 멤브레인필터로 여과한 것을 시험용액으로 한다.

④ 시험조작

- 정량시험

표준용액과 시험용액을 각각 10㎕씩 주입하여 앞의 조건에서 시험한다. 표준용액 중 카테킨(또는 카페인)의 피크의 면적에 의해 구한 검량선을 사용하여 시험용액중 카테킨(또는 카페인)의 농도(㎍/㎖)를 구하고, 다음의 식에 의하여 검체 중 카테킨의 함량(%)과 카페인의 함량(%)을 구한다.

[계산식]

Ⓐ [eqn: rm개별~카테킨(또는~카페인)함량(%)=C×{V} over {검체량}×{1}over{10,000}]

C : 시험용액 중 개별 카테킨(또는 카페인)의 농도(㎍/㎖)

V : 시험용액의 전량(㎖)

Ⓑ 카테킨 함량(%)= EGC(%)+EGCG(%)+EC(%)+ECG(%)

2. 매실추출물

항목	규격	시험방법
성상	고유의 색택과 향미를 가지며 이미․이취가 없어야 함	-
유기산 산도(%)	표시량 이상 (구연산으로서)	제2. 1. 15. 2)
수분(%)	15.0 이하 (단, 액상제품은 제외)	제2. 1. 1)
시안화합물	불검출	제2. 1. 15. 3)
타르색소	불검출	제2. 4
대장균군	음성	제2. 7. 5)

3. 배아

항목	규격					시험방법
	쌀배아	밀배아	쌀배아 제품	밀배아 제품	배아혼합 제품
성상	고유의 색택과 향미를 가지며 이미․이취가 없어야 함					-
조단백질(%)	표시량 이상					제2. 1. 3). (1)
총토코페롤 (㎎/100g)	표시량의 80~180%					제2. 10. 2). (6)
β-토코페롤 (㎎/100g)	—	표시량 이상	—	표시량 이상	—	제2. 10. 2). (6)
ɤ-오리자놀 (㎎/100g)	표시량 이상	—	표시량 이상	—	—	제3. Ⅱ. 3. (2). 1)
수분(%)	8.0 이하		8.0 이하 (다만, 액상제품은 제외)			제2. 1. 1)
대장균군	음성					제2. 7. 5)

4. 알로에

항목	규격	시험방법
성상	고유의 색택과 향미를 가지며 이미․이취가 없어야 함	-
알로인(mg)	표시량의 80.0~120.0%	알로인
만노스 또는 글루코스(mg)	표시량의 80.0~120.0%	만노스 또는 글루코스
β-sitosterol 1-3-0-6-palmitoyl-β-D-glucopyranoside(SPG) 및 β-sitosterol 1-3-0-β-D- glucopyranoside(SG) (mg)	표시량의 80.0~120.0%	SPG 및 SG 확인 시험법
수분	10.0이하 (액상제품은 제외)	재2. 1. 1)
고형분	0.5이상 (알로에겔에 한하며, 농축액의 경우 농축배수를 고려하여 환산)
조단백질(%)	1.0 이상 (알로에겔 제품에 한하며 200:1 알로에겔 분말을 기준으로 환산)	제2. 1. 3). (1)
회분	13~40 (알로에겔에 한하며 200:1 알로에겔 분말을 기준으로 함), 8~25 (알로에분말에 한함)	제2. 1. 2)
조섬유(%)	7~15(알로에분말에 한함)	제2. 1. 5). (2)
무수바바로인(%)	1.0이하(알로에겔 분말), 0.005 이하(알로에겔에 적용하며, 농축배수 및 함량에 따라 환산 적용), 5.0이하(알로에분말)
대장균군	음성	제2. 7. 5)
세균수	1㎖당 100이하 (액상제품에 한함)	제2. 7. 2)
보존료(g/kg)	식품첨가물공전에 적합

1) 알로인

(1) 안트라퀴논계물질(무수바바로인으로)

① 장치

분광광도계(Spectrophotometer)

② 시험용액의 조제

알로에건조분말의 경우 약 1g, 알로에겔분말의 경우 약 5g 또는 알로에겔인 경우 10～50g을 취하여 메탄올 5～10㎖를 취하여 적신 다음 약 60℃의 물 10㎖를 가하여 혼합한 후 다시 약 60℃의 물 75㎖를 가하여 30분간 진탕한다. 냉각, 여과하여 여액은 물로 200㎖가 되게 한다. 이 여액 10㎖를 60% 염화제2철용액 1㎖와 진한 염산 6㎖가 들어있는 용기에 가한 후 환류냉각기를 설치하여 끓는 수욕조에서 4시간동안 역류시킨다. 이를 식힌 후 분액여두에 옮기고 냉각기 및 수기는 물 4～5㎖씩으로 세척하고 세액은 먼저의 분액여두에 합하고, 이에 1N 수산화나트륨 4㎖, 사염화탄소 20㎖씩으로 3회 추출한 후 사염화탄소층을 물 10㎖로 세척한 다음 사염화탄소로서 100㎖로 하고 이 액 20㎖를 수욕상에서 증발건조한 후 그 잔류물에 0.5% 메탄올초산마그네슘용액 10㎖를 가하여 용해한 것을 시험용액으로 한다.

③ 시험조작

시험용액은 액층 1cm, 파장 512nm에서 메탄올을 대조액으로 하여 흡광도를 측정하고 다음식에 따라 hydroxyanthracene유도체 성분을 무수바바로인(barbaloin)으로 계산한다.

안트라퀴논계물질(무수바바로인으로) 함량(%)

[eqn: rm ={{A} over {240}}×10×{100} over {20}×{200}over{10}×{1}over{S}]

S∶검체 채취량(g)

A∶흡광도

주1. 검체가 기름을 다량 함유한 경우 에테르 등 용매를 사용하여 기름을 제거하는 것이 필요하다.

주2. 혼합된 다른 성분이 결과에 영향을 미치는 경우 이를 보정하여 시험한

2) 만노스 및 글루코스

① 장치 및 시약

- 농황산(특급)

- 2N 수산화나트륨 : 정제한 물에 수산화나트륨(특급) 80g을 용해하여 정확히 1ℓ로 한다.

- 투석용 튜브 : SPECTRAPOR MEMBRENSE TUBING mwco #3,500 또는 이와 동등한 기능을 가진 것

- 효소시약 : F-kit  글루코오스/플럭토오스(베링거․만하임(주)제)

A액 : 트리에탄올아민 버퍼 (pH 7.6), NADP(Nicotinamide adenin dinucleotidephosphate) 64㎎, ATP (Adenosinetriphosphate)  160㎎, MgSO4, 안정화제 전량 약 5g 27㎖의 증류수에 용해한다.

B액 : HK(Hexokinase) 약 200U, G6PDH(Glucose-6-phosphate dehydrogenase)  약 100U

C액 : PGI(Phosphoglencose isomerase)  약 490U

D액 : PMI(Phosphomannose isomerase)  약 300U

② 시험용액의 조제

시료를 분쇄한 것 0.5g에 정제수 50㎖를 가한다. 액상 형태의 것은 50㎖를 투석용 튜브에 넣어 양끝을 묶어 3ℓ의 정제수가 담긴 용기에 넣고 매달아 교반기를 이용하여 교반장치로 한다. 교반이 끝나면 투석용 튜브 내의 잔류물 전량에 농황산을 가하여 2.3%농도로 조제한다.

끓는 수욕 중에 2.5시간 가수분해한다. 냉각 후 2N 수산화나트륨 용액으로 중화하여, 정제수로 정확히 100㎖로 하여 이를 시료용액으로 한다.

③ 시험조작

시험관에 A액 1.0㎖, 시료 용액 0.1㎖ 및 정제수 1.9㎖를 가하여 잘 혼합한 후 3분 후에 파장 340㎚에서 흡광도 E1을 측정한 다음 B액 0.02㎖를 가하여 반응이 종료된 후(약 10～15분후) 흡광도 E2를 측정한다. 여기에 C액 0.02㎖를 가하여 혼합한 후 반응이 종료된 후(10～15분후) 흡광도 E3를 측정한다. 마지막으로 0.02㎖의 D액을 넣어 반응이 종료된 후(30～60분후) 흡광도 E4를 측정한다. 동일한 방법으로 정제수를 사용하여 공시험으로 한다.

정제수와 시료용액의 흡광도 측정치로부터 글루코오스와 만노스의 △E를 산출한다.

[계산식]

△E(글루코오스) = Eg - Eb1

△E(만노스) = EM - Eb2

Eg : (E2 - E1) 시료용액  EM : (E4 - E3 )

Eb1 : (E2 - E1) 정제수   Eb2 : (E4 - E3)

다음 식으로부터 글루코오스 및 만노스 양을 구한다(%)

글루코오스 =	3.02×180.16	×△E×F×0.1* = 0.0864×△E×F
	6.3×1×0.1×1000

만노스 =	3.02×180.16	×△E×F×0.1* = 0.0875×△E×F
	6.3×1×0.1×1000

3.02 : 글루코오스 반응량(㎖)

3.06 : 만노스 반응량(㎖)

180.16 : 글루코오스 또는 만노스 분자량

6.3 : 흡광계수

1 : 셀 크기(㎝)

0.1 : 검체량(㎖)

F : 시료용액의 희석배수(제품을 파쇄한 경우 200, 액상의 형태는 2)

0.1* : % 환산계수

[비고]

① E2의 흡광도가 1000이상인 경우 시료용액을 희석하여 재시험한다.

희석한 경우 희석배수를 곱하여 산출한다.

3) SPG 및 SG 확인 시험법

① 장치 및 시약

- β-Sitosterol 표준용액※

- β-Sitosterol(특급) 10㎎을 클로로포름 5㎖에 용해한다.

- 컬럼 크로마토그래피용 실리카겔 : Kiesel gel 60, 70-230 mesh, 또는 이와 동등한 기능을 가진 것

- 박층판 : Pre-corted TLC plates silica gel F254, 또는 이와 동등한 기능을 가진 것

- 발색제 : Methanol과 황산의 동량 혼합액

② 시험용액의 조제

비커에 컬럼 크로마토그래피용 실리카겔 30g을 취하여 hexane:acetone(20:1) 100㎖를 가하여 교반한 후 컬럼 크로마토그래피에 충진한다.

제품 분말 5g, 액상은 동결 건조 분말 5g을 빈 플라스크에 취한 후 chloroform 100㎖를 가하여 실온에서 때때로 흔들면서 24시간 방치 추출한다. 이 chloroform 추출액을  40℃ 이하에서 감압 농축 건고한 뒤, 소량의 hexane:acetone(20:1) 혼합액으로 용해한다. 이를 미리 만든 컬럼 크로마토그래피에 넣고 hexane:acetone (20:1) 혼합액 300㎖를 흘린 후 순차적으로 hexane:acetone 혼합액 (10:1), (5:1) 및 아세톤 각 300㎖를 사용하여 용해한 후 각 부분을 분별 채취한다. 이 분별 채취한 용액을 40℃이하에서 감압 증류로 5㎖까지 농축하여 박층 크로마토그래피용  시료용액으로 한다.

③ 시험조작

표준용액 및 박층 크로마토그래피용 시료용액 각 5㎕를 박층판 하단 2㎝되는 곳(원선) 도포하여 바람에로 말린 후 chloroform:methanol(9:1)을 전개용매로 하여 원선으로부터 10㎝ 되는 곳까지 용매를 전개시킨다.

전개 종료 후 박층판을 바람에 말려 발색제를 분무하고, 110℃에서 5분간 가열시 박층 크로마토그래피용 시료 용액을 도포한 박층 판 위에 보라색의 반점을 확인하여 표준용액으로부터 얻어지는 반점의 이동 거리보다 아래로 SPG 및 SG의 반점이 있어야 한다.

그 이동거리의 비는 SPG의 경우 약 0.4± 0.1, SG의 경우 약 0.15±0.05이어야 한다.

SPG =	시료용액으로부터 얻어지는 반점의 중심까지의 이동거리	= 0.4± 0.1
	전개용액의 이동거리

SG =	시료용액으로부터 얻어지는 반점의 중심까지의 이동거리	= 0.15± 0.05
	전개용액의 이동거리

※ SPG 및 SG는 알로에 특유의 β-Sitosterol의 화합물이고, 표준품이 없으므로  β-Sitosterol을 표준품으로 하였다.

5. 인삼

항목	규격	시험방법
성상	고유의 색택과 향미를 가지며 이미․이취가 없어야 함	-
인삼성분 함량(mg/g)	표시량의 80.0~120.0%
인삼성분 확인	진세노사이드(Ginsenoside) Rb1 및 Rg1이 확인
고형분 (%)	60.0 이상 (인삼농축액에 한함)	제2. 1. 1)에 따라 시험하고 100에서 수분(%)를 감함.
수분 (%)	9.0 이하	제2. 1. 1)
카라멜색소	불검출 (인삼농축액을 함유하고 있는 제품에 한함)	제2. 1. 15. 4)
물불용성침전물 (%)	3.0 이하 (인삼농축액에 한함)	제2. 1. 15. 5)
입도 (%)	100메쉬를 통과한 양이 85.0 이상 (인삼분말에 한함)	제2. 1. 15. 10)
세균수	1g당 100이하 (액상제품에 한함)	제2. 7. 2)
대장균군	음성	제2. 7. 5)
잔류농약	식품공전 제3. 식품일반에 대한 공통 기준 및 규격6. 기준 및 규격의 적용 5) 인삼의 농약 잔류허용기준에 따른다.

1) 인삼성분 함량

(1) 인삼농축액 또는 인삼 농축액 분말

① 시험조작

검체 1~2g을 정밀히 달아 삼각플라스크에 넣고 물 60㎖에 녹여 분액깔때기에 옮기고 에테르 60㎖로 씻은 다음 물층을 수포화 부탄올 60㎖로 3회 추출한다.

추출액을 모두 합쳐서 물 50㎖로 씻는다. 수포화 부탄올층을 미리 항량으로 한 농축 플라스크에 옮겨 감압 농축한 후 105℃에서 20분간 건조하고, 다시 데시케이터에서 30분간 식혀 무게를 달아 다음 식에 따라 인삼성분(조사포닌)의 양을 구한다.

[계산식]

인삼성분 함량(㎎/g) ＝ [eqn: rm { A—B} over {S }]

A : 수포화 부탄올층을 농축 건조한 후의 플라스크의 무게

B : 항량으로 한 빈 플라스크의 무게(㎎)

S : 검체의 채취량(g)

다만, 인삼성분과 유사한 성분의 혼입을 확인하기 위해서는 무게를 단 후의 농축액을 메탄올에 녹여 아래와 같은 조건으로 측정한다.

(고속액체크로마토그래피의 측정조건 예)

- 칼럼 : 탄수화물 분석용

- 용매 : 아세토니트릴, 물, 부탄올(80:20:15)

- 검출기 : RI

(2) 인삼분말

① 시험조작

100메쉬의 표준체를 통과한 검체 약 5g을 달아 250㎖의 환류용 플라스크에 취한다. 수포화 부탄올 용액 50㎖를 가하고 70~80℃의 수욕에서 1시간 환류냉각한 후 식히고 여과한 다음 250㎖ 분액여두에 옮긴다. 잔류물에 대하여 위의 조작을 2회 더 반복한다. 분액여두에 증류수 50㎖를 가한 다음 격렬히 흔들어 물층과 부탄올층이 완전히 분리될 때까지 정치한다. 물층(하층)을 제거하고 부탄올층을 미리 항량으로 한 농축플라스크에 옮겨 수욕중에서 감압농축한 다음 그 잔류물에 에테르 50㎖를 가하고 약 46℃의 수욕에서 30분간 환류냉각하고 에테르를 제거한다. 잔류물은 항량이 될 때까지 건조하고 데시케이터에서 방냉한 후 무게를 달고 상기 ①의 계산식에 따라 인삼성분의 함량을 구한다.

(3) 인삼성분함유제품

① 시험조작

검체 약 10g을 달아 플라스크에 취하고 메탄올 50㎖를 가하여 상온에서 약 1시간 동안 교반추출한 다음 농축플라스크에 여과한다. 잔류물에 대하여 위의 조작을 반복한 다음 여과지는 메탄올 50㎖로 세척한다. 합쳐진 메탄올액을 수욕중에서 감압농축한 후, 농축잔류물을 증류수 50㎖로 용해하여 250㎖ 분액여두에 넣고 여기에 수포화부탄올 용액 50㎖를 가한 다음 격렬히 흔들어 물층과 부탄올층이 완전히 분리될 때까지 정치한다. 부탄올층(상층)을 따로 모으고 다시 물층에 대하여 물포화부탄올 추출조작을 위와 동일한 방법으로 2회 더 반복한다. 회수된 부탄올 용액 전액을 250㎖ 분액여두에 옮긴 후 증류수 50㎖를 가하고 격렬히 흔들어 물층과 부탄올층을 완전히 분리시킨다. 물층(하층)을 제거하고 부탄올층을 미리 항량으로 한 농축플라스크에 옮겨 수욕중에서 감압농축한 다음 그 잔류물에 에테르 50㎖를 가하고 약 46℃ 수욕에서 30분간 환류냉각하고 에테르를 제거한다. 잔류물은 항량이 될 때까지 건조하고 데시케이터에서 방냉한 후 무게를 달고 상기 ①의 계산식에 따라 인삼성분의 함량을 구한다.

2) 인삼성분 확인

① 시험용액의 조제

상기 1) 인삼성분 함량 시험법의 건조물에 10배의 메탄올을 가하여 완전히 용해한 다음 여과(0.45㎛)하여 사용한다.

② 표준용액의 조제

진세노사이드 Rb1 및 Rg1 표준품을 메탄올에 1% 용액이 되도록 녹인 후 여과(0.45㎛)하여 사용한다.

③ 박층크로마토그래피 시험법

㉮ 전개용매

Ⓐ 클로로포름 : 메탄올 : 물(65 : 35 : 10, v/v/v) (하층사용)

Ⓑ 1-부탄올 : 에틸아세테이트 : 물(5 : 1 : 4, v/v/v) (상층사용)

㉯ 시험조작

시험용액과 표준용액을 미리 110℃에서 미리 15분간 건조하고 실온에서 30분간 식힌 실리카겔판에 찍어 아래의 전개용매로 전개한 후, 10% 황산용액 또는 30% 황산-에탄올 용액을 분무하여 110℃에서 5~10분간 건조하여 발색시킨다. 건조된 실리카겔판에 나타난 시험용액과 표준용액 반점의 색과 위치(Rf)치를 육안 또는 자외선(약365㎚)에서 비교․확인한다.

③ 고속액체크로마토그래피 시험법

㉮ 시험조작

시험용액과 표준용액을 아래의 분석조건에 따라 액체크로마토그래피에 주입, 분석하여 시험용액과 표준용액의 피크를 비교․확인한다.

㉯ 시험조건

Ⓐ 칼럼 : NH2 칼럼, 탄수화물분석용 칼럼 또는 이화 동등한 것

Ⓑ 이동상

- 시차굴절계(RI) 검출기를 사용할 경우

․ 아세토니트릴 : 물 : 부탄올(80 : 20 : 10, v/v/v)

․ 아세토니트릴 : 물(80 : 20, v/v)

- 자외선(UV, 203㎚) 검출기를 사용할 경우

․ 아세토니트릴 : 물(30 : 70, v/v)

Ⓒ 유속

- RI 검출기를 사용할 경우 : 1.0㎖/min

- 자외선(UV) 검출기를 사용할 경우 : 1.5㎖/min

6. 엽록소

항목	규격			시험방법
	맥류약엽엽록소함유제품, 맥류약엽엽록소원말	알팔파엽록소함유제품, 알팔파엽록소원말	해조류엽록소함유제품, 기타식물류엽록소함유제품, 해조류엽록소원말, 기타식물류엽록소원말
성상	고유의 색택과 향미를 가지며 이미․이취가 없어야 함			-
총엽록소 (㎎/100g)	표시량 이상			총엽록소
칼슘 (mg/100g)	—	800이상 (알팔파엽록소원말은 1,600이상)	—	제2. 10. 1). (2)
헥사코사놀	확인	—	—	헥사코사놀
에스.오.디 (unit/g) (Superoxide dismutase)	400 이상	—	—	에스.오.디
단백질응고 시험	양성	—	—	제2. 1. 15. 6)
총페오포르바이드 (㎎/100g)	30.0 이하	30.0 이하	—	제3. Ⅷ. 2. (3)
수분(%)	8.0 이하 (다만, 액상제품, 연질캅셀제품은 제외)			제2. 1. 1)
타르색소	불검출			제2. 4
대장균군	음성			제2. 7. 5)

1) 총엽록소

① 시험용액의 조제

총엽록소 약 7㎎에 상당하는 검체를 정밀히 달아, 이에 85% 아세톤 50㎖를 가하고 해사 일정량을 추가하여 잘 분쇄한 후 냉암소에서 하룻밤 방치한 후 3G-2 유리여과기를 사용하여 여과한다. 갈색플라스크내의 잔류물은 85% 아세톤 25㎖를 가하여 10분간 유리봉으로 저어 다시 여과한다. 아세톤액이 착색되지 않을 때까지 반복 조작한 후 여액을 아세톤에 가하여 200㎖로 한다. 이 액 20㎖를 갈색분액깔때기에 취하여 넣고 에테르 50㎖ 및 5% 황산나트륨 50㎖를 가해 완만히 흔들어 진탕한 후 마개를 열어 에테르가스를 방출한 후 마개를 하여 1분간 진탕한다. 정치 후 물층(하층)을 분리하여 여기에 에틸에테르 10㎖를 가하여 추출하는 과정을 2회 반복한 후 에테르층을 합하여 5% 황산나트륨용액 50㎖씩으로 3회 세척한다. 세척된 에테르층은 무수황산나트륨을 통과 탈수시켜 여과한 후 갈색분액깔때기 및 여과지를 에테르로 씻어 먼저의 액에 합하고 이에 에테르를 가해 100㎖로 한 것을 시험용액으로 한다.

② 시험조작

[장치 및 시험조건]

분광광도계(Spectrophotometer)

[시험방법]

시험용액은 에테르를 대조액으로 하여 액층 1㎝셀을 사용하여 파장 642.5㎚ 및 660㎚에 대하여 흡광도 A1 및 A2를 측정하고 다음 식에 의해 총엽록소의 함량을 구한다.

[계산식]

총엽록소(㎎%)＝C×[eqn: rm { 100} over {1,000 } × { 200} over {20 } × { 100} over { S}]

C(총엽록소 ㎎/ℓ)∶7.12×A2＋16.8×A1

S∶검체채취량(g)

2) 헥사코사놀확인시험

① 표준용액의 조제

n-헥사코사놀 표준품(순도 96%이상) 약 5㎖를 취하여 클로로포 름 5㎖를 가해 용해시켜 표준용액으로 한다.

② 시험용액의 조제

검체 1g을 취하여 클로로포름 50㎖를 가해 10분간 초음파 추출 후 여과하여 수욕상에서 감압하여 클로로포름을 제거한다. 잔류물에 클로로포름 5㎖를 가해 녹인 것을 시험용액으로 한다.

③ 시험조작

[장치 및 시험조건]

박층크로마토그래프(Kiesselgel 60, 두께 0.25, Merck)

[시험방법]

시험용액 및 표준용액 20㎕씩을 박층판에 점적하여 벤젠‧초산에틸혼액(2:1)을 전개용매로 하여 약 10㎝ 전개시킨 후 박층판을 건조한다. 이에 10% 황산을 균등히 분무하고, 100℃에서 약 10분간 가열할 때 검액에서 얻은 여러개의 반점 중 1개의 반점이 표준용액에서 얻은 갈색의 반점과 색조 및 Rf치(0.5 부근)가 같은 것이 확인되어야 한다.

3) 에스.오.디(Superoxide dismutase)

① 시험용액의 조제

검체 약 1g을 정밀히 달아 이에 50mM 인산칼륨완충액 100㎖를 가하여 충분히 혼합한 후 원심분리(13,000×g, 10분)하여 상등액을 분취한다. 다시 침전물에 50mM 인산칼륨완충액 80㎖를 가해 동일하게 조작하고 상등액을 분취한다. 이를 먼저의 상등액에 합하고, 다시 50mM 인산칼륨완충액을 가해 정확히 200㎖로 하고 이를 시험용액으로 한다. 검체가 세입, 입상 등의 경우 필요하면 유리봉으로 균일하게 분말화하여 검체로 한다.

Ⓐ 50mM 인산칼륨완충액∶인산2수소 칼륨 6.80g을 취해, 물 500㎖를 가하여 용해하고 1N 수산화칼륨용액으로 pH 7.8로 조정하고 물을 가해 정확히 1,000㎖로 한다.

Ⓑ 250mM 인산칼륨완충액 : 인산2수소 칼륨 34.0g을 취해, 물  500㎖를 가하여 용해하고 1N 수산화칼륨용액으로 pH 7.8로 조정하고 물을 가해 정확히 1,000㎖로 한다.

Ⓒ 1mM 에틸렌디아민4초산2나트륨용액 : 10mM 에틸렌디아민4초산2나트륨용액 10㎖에 물을 가하여 정확히 100㎖로 한다.

Ⓓ 0.1mM 싸이토크롬 C용액 : 싸이토크롬 C(Sigma사, Type말 심장) 12.4㎎에 물을 가해 용해하여 정확히 10㎖로 한다. 본 용액은 냉장보관하고, 보존기간은 2주 정도로 한다.

Ⓔ 0.5mM 잔틴용액 : 잔틴(Sigma사, Grade V) 7.6㎎을 취해 이에 물 10㎖를 가해 잘 혼합한 후, 0.1N 수산화나트륨용액 2㎖를 가해 용해하고, 물을 가해 정확히 100㎖로 한다. 본 용액은 냉동 보존하고, 보존기간은 1개월 정도로 한다.

Ⓕ] 잔틴옥시다제용액 : 잔틴옥시다제(Beringer사) 50㎕에 희석액 950㎕를 가한다. 본 용액은 냉동보존하고, 보존기간은 1개월 정도로 한다.

Ⓖ 희석액 : 황산암모늄 26.4g을 소량의 물에 용해하고, 10mM  에틸렌디아민4초산2나트륨용액 10㎖를 가하고 암모니아수로 pH 7.8로 조정하고 물을 가해 정확히 100㎖로 한다.

Ⓗ 10mM 에틸렌디아민4초산2나트륨 용액 : 에틸렌디아민4초산2나트륨 372.24㎎을 취해 물을 가해 용해하여 정확히 100㎖로 한다.

① 시험조작

250mM 인산칼륨완충액 1mM 에틸렌디아민4초산2나트륨용액, 0.1mM 싸이토크롬 C용액 및 0.5mM 잔틴용액 각 1㎖씩을 정확히 시험관에 취하여, 이를 E용액으로 한다. 광학 셀(층장 10㎜, 1㎖용)에 물 80㎕, 시험용액 약 50~200㎕의 일정량 및 E액 400㎕를 넣고, 50mM 인산칼륨완충액을 가하여 980㎕로 한다. 여기에 잔틴옥시다제용액 20㎕를 가해 즉시 파장 550nm에서 흡광도 변화를 60초간 측정하여 반응 전‧후의 흡광도차를 구한다. 별도로 시험용액 대신에 50mM 인산칼륨완충액을 사용하여 동일하게 조작하고 흡광도차를 구한다. 50mM 인산칼륨완충액에서 얻은 흡광도차를 시험용액에서 얻은 흡광도차로 나눈 값(R)을 본 측정의 참고로 하고 이 값이 1.6~2.4 좋게는 2.0부근이 되도록 본 측정의 시험용액을 가감한다. 시험용액 약 50～200㎕의 범위에서 측정할 수 없는 경우는, 시험용액의 농도를 조절한다.

주) 본 시험에 사용하는 물, 시험용액, E액, 50mM 인산칼륨완충액, 잔틴옥시다아제용액은 수욕중에서 25±1℃에서 5분 이상 방치한 것을 사용한다.

[장치 및 시험조건]

분광광도계(Spectrophotometer)

[본측정]

광학 셀(층장 10㎜, 1㎖용)을 3~4개를 사용하되 이 중 하나를 공시험용 셀(S)로 하고, 그외는 시험용액 측정용(T)으로 한다. 셀S 및 셀T에 각각 물 80㎕, E액 400㎕씩을 정확히 가하고, 셀T에 R이 2 전후 되도록 시험용액을 단계적으로 양을 변화하여 각각 정확하게 가한다. 다시 셀S 및 셀T에 50mM 인산칼륨완충액을 가해 각각을 980㎕로 하고 25℃의 수욕에 넣어 방치한다. 셀S 및 셀T에 잔틴옥시다제용액 20㎕를 각각에 정확히 가하고, 물을 대조액으로 하여 즉시 파장 550nm에 대해 흡광도 변화를 60초간 측정하고, 반응 전‧후의 흡광도 차를 구한다. 시험용액의 흡광도차를 각각 a1, a2, a3……로 하고, 공시험의 흡광도차를 A로 한다. 첨가한 시험용액 양(㎕)을 횡축으로, 공시험과 시험용액의 흡광도차의 비 A/a(A/a1, A/a2, A/a3……)를 종축으로 취하고 검량선을 작성하여 A/a가 2.0에 상당하는 시험용액의 양(㎕)을 구한다. 싸이토크롬 C의 환원을 50% 저해하는데 요하는 superoxide dismutase의 양을 1효소단위(A/a＝2.0)로 하고 다음 식에 의해 효소활성단위를 얻는다.

[계산식]

[eqn: rm = {rm {1} over {검량선에서~읽은~ 양(㎕)} × { 200 } × {1,000}} over {rm 검체채취량(g)}]       에스‧오‧디의 효소활성(unit/g)

7. 홍삼

항목	규격	시험방법
성상	고유의 색택과 향미를 가지며 이미․이취가 없어야 함	-
홍삼성분 함량(㎎/g)	표시량 이상	기능성분(지표성분) 시험법
홍삼성분 확인	진세노사이드(Ginsenoside) Rb1 및 Rg1이 확인	기능성분(지표성분) 시험법
고형분(%)	60.0 이상	제2. 1. 1) 에 따라 시험한 후 100에서 수분(%)를 감함.
수분(%)	① 홍삼농축액분말 : 7.0이하 ② 홍삼분말 : 8.0이하	제2. 1. 1)
카라멜색소	불검출 (인삼농축액을 함유하고 있는 제품에 한함)	제2. 1. 15. 4)
물불용성침전물 (%)	3.0 이하 (인삼농축액에 한함)	제2. 1. 15. 5)
입도 (%)	100메쉬를 통과한 양이 85.0 이상 (인삼분말에 한함)	제2. 1. 15. 10)
세균수	① 홍삼농축액, 홍삼농축액분말, 홍삼성분함유제품(액상제품에 한함) : 1g당 100이하 ② 홍삼분말 : 1g당 50,000이하.	제2. 7. 2)
대장균군	음성	제2. 7. 5)
잔류농약	식품공전 제3. 식품일반에 대한 공통 기준 및 규격6. 기준 및 규격의 적용 5) 홍삼의 농약 잔류허용기준에 따른다.

1) 홍삼성분 함량

(1) 홍삼농축액 또는 홍삼농축액 분말

① 시험조작

검체 약 7.0g을 100㎖의 농축플라스크에 취하고 감압농축 건고한 후 수포화부탄올 50㎖를 가하여 환류 냉각기를 붙여 수욕중에서 70~80℃로 약 1시간 가열 추출한 다음 냉각한 후 여과하고 잔류물에 대하여 같은 조작을 계속 2회 반복한다. 여지는 수포화부탄올 10㎖로 세척하고 여액 및 세액을 합하여 250㎖ 분액 깔때기에 넣고 물 20㎖로 잘 진탕시켜 수세한다.

수포화부탄올추출액 전액을 미리 항량으로 한 농축플라스크에 옮겨 수욕중에서 감압농축하여 부탄올을 제거한 다음 그 잔류물에 에테르 50㎖를 넣고 환류냉각기를 붙여 수욕중에서 36℃로 30분간 가열하여 탈지시킨 후 에테르를 제거한다.

잔류물은 105℃에서 20분간 건조하고 다시 데시케이터에서 30분간 식혀 무게를 달아 다음 식에 따라 홍삼성분(조사포닌)의 양을 구한다.

[계산식]

홍삼성분(㎎／g)＝[eqn: rm { A—B} over { S}]

A : 수포화 부탄올층을 농축 건조한 후 의 플라스크의 무게(㎎)

B : 항량으로 한 빈 플라스크의 무게(㎎)

S : 검체의 채취량(g)

(2) 홍삼분말

① 시험조작

100메쉬의 표준체를 통과한 검체 약 5g을 달아 250㎖의 환류용 플라스크에 취한다. 수포화 부탄올용액 50㎖를 가하고 70~80℃의 수욕에서 1시간 환류냉각한 후 식히고 여과한 다음 250㎖ 분액여두에 옮긴다. 잔류물에 대하여 위의 조작을 2회 더 반복한다. 분액여두에 증류수 50㎖를 가한 다음 격렬히 흔들어 물층과 부탄올층이 완전히 분리될 때까지 정치한다. 물층(하층)을 제거하고 부탄올층을 미리 항량으로 한 농축플라스크에 옮겨 수욕중에서 감압농축한 다음 그 잔류물에 에테르 50㎖를 가하고 약 46℃의 수욕에서 30분간 환류냉각하고 에테르를 제거한다. 잔류물은 항량이 될 때까지 건조하고 데시케이터에서 방냉한 후 무게를 달고 상기 ①의 계산식에 따라 홍삼성분의 함량을 구한다.

(3) 홍삼성분함유식품

① 시험조작

검체 약 10g을 달아 플라스크에 취하고 메탄올 50㎖를 가하여 상온에서 약 1시간 동안 교반추출한 다음 농축플라스크에 여과한다. 잔류물에 대하여 위의 조작을 반복한 다음 여과지는 메탄올 50㎖로 세척한다. 합쳐진 메탄올액을 수욕중에서 감압농축한 후, 농축잔류물을 증류수 50㎖로 용해하여 250㎖ 분액여두에 넣고 여기에 수포화부탄올용액 50㎖를 가한 다음 격렬히 흔들어 물층과 부탄올층이 완전히 분리될 때까지 정치한다. 부탄올층(상층)을 따로 모으고 다시 물층에 대하여 수포화부탄올 추출조작을 위와 동일한 방법으로 2회 더 반복한다. 회수된 부탄올 용액 전액을 250㎖ 분액여두에 옮긴 후 증류수 50㎖를 가하고 격렬히 흔들어 물층과 부탄올층을 완전히 분리시킨다. 물층(하층)을 제거하고 부탄올층을 미리 항량으로 한 농축플라스크에 옮겨 수욕중에서 감압농축한 다음 그 잔류물에 에테르 50㎖를 가하고 약 46℃ 수욕에서 30분간 환류냉각하고 에테르를 제거한다. 잔류물은 항량이 될 때까지 건조하고 데시케이터에서 방냉한 후 무게를 달고 상기 ①의 계산식에 따라 홍삼성분의 함량을 구한다.

2) 홍삼성분의 확인

① 시험용액의 조제

상기 1) 홍삼성분 함량 시험법의 건조물에 10배의 메탄올을 가하여 완전히 용해한 다음 여과(0.45㎛)하여 사용한다.

① 표준용액의 조제

진세노사이드 Rb1 및 Rg1 표준품을 메탄올에 1% 용액이 되도록 녹인 후 여과(0.45㎛)하여 사용한다.

② 시험조작

Ⓐ 박층크로마토그래피

[장치 및 시험조건]

- 전개용매

Ⓐ 클로로포름 : 메탄올 : 물(65 : 35 : 10, v/v/v) (하층 사용)

Ⓑ 1-부탄올 : 에틸아세테이트 : 물(5 : 1 : 4, v/v/v) (상층 사 용)

[시험방법]

시험용액과 표준용액을 미리 110℃에서 15분간 건조하고 실온에서 30분간 식힌 실리카겔판에 찍어 아래의 전재용매로 전개한 후, 10% 황산용액 또는 30% 황산-에탄올 용액을 분무하여 110℃에서 5~10분간 건조하여 발색시킨다. 건조된 실리카겔판에 나타난 시험용액과 표준용액 반점의 색과 위치(Rf치)를 육안 또는 자외선(약365㎚)에서 비교․확인한다.

Ⓑ 고속액체크로마토그래피

[장치 및 시험조건]

- 칼럼 : NH2 칼럼, 탄수화물분석용 칼럼 또는 이와 등등한 것

- 이동상

- 시차굴절계(RI) 검출기를 사용할 경우

․ 아세토니트릴 : 물 : 부탄올(80 : 20 : 10, v/v)

․ 아세토니트릴 : 물(80 : 20, v/v)

- 자외선(UV, 203㎚) 검출기를 사용할 경우

․ 아세토니트릴 : 물(30 : 70, v/v)

- 유속

- RI 검출기를 사용할 경우 : 1.0㎖/min

- 자외선(UV) 검출기를 사용할 경우 : 1.5㎖/min

[시험방법]

시험용액과 표준용액을 아래의 분석조건에 따라 액체크로마토그래피에 주입, 분석하여 시험용액과 표준용액의 피크를 비교․확인한다.

Ⅶ. 발효미생물류

1. 식물추출발효

항목	규격	시험방법
성상	고유의 색택과 향미를 가지며 이미․이취가 없어야 함	-
유기산 산도(%)	0.3 이상 (젖산으로서)	제2. 1. 15. 7)
환원당, 효모수, 유산군수, 비타민 B, 비타민B₂중 3가지 이상 적합하여야 한다	① 환원당(%) : 50.0% 이상표시량 이상	제2. 1. 5). (1). ②
	② 효모수 : 1,000,000/g 이상표시량이상	제2. 1. 15. 8)
	③ 유산균수 : 1,000,000/g 이상	제2. 7. 8)
	④ 비타민B₁(㎎/100g) : 0.2 이상	제2. 10. 2). (2)
	⑤ 비타민B₂(㎎/100g) : 0.05 이상	제2. 10. 2). (3)
대장균군	음성	제2. 7. 5)
메탄올(%)	0.01이하	식품공전 제4. 18-1. 4). (3)

2. 프로바이오틱스

항목	규격	시험방법
성상	고유의 색택과 향미를 가지며 이미․이취가 없어야 함	-
프로바이오틱스수	표시량 이상	유산균 제2 .7. 8)
		비피더스균 제2. 7. 8). (2)
		혼합유산균이용제품 유산균수와 비피더스균의 시험방법에 따라 시험한 후 유산균수와 비피더스균수를 합하여 산출
대장균군	음성	제2. 7. 5)

3. 홍국

항목	규격	시험방법
성상	고유의 색택과 향미를 가지며 이미․이취가 없어야 함	-
총 모나콜린 K 함량	표시량의 80.0% ~ 120.0%	총 모나콜린 K 함량
활성형 모나콜린K (베타-히드록시 산 형태)	확인	활성형 모나콜린K
시트리닌(㎍/㎏)	50 이하	제2. 1. 15. 9)
수분(%)	10.0 이하 (단, 액상제품은 제외)	제2. 1. 1)
세균수	1㎖당 100이하 (액상제품에 한함)	제2. 7. 2)
대장균군	음성	제2. 7. 5)

1) 총 모나콜린 K 함량

① 표준용액의 조제

㉮ 비활성형 모나콜린 K 표준용액의 조제

메비놀린(mevinolin, monacolin K) 표준품 10㎎을 정밀하게 달아 75% 에탄올로 50㎖에 녹여 표준용액으로 한다(0.200㎎/㎖).

㉯ 활성형 모나콜린 K 표준용액의 조제

메비놀린(mevinolin, monacolin K) 표준품 10㎎을 정밀하게 달아 75% 에탄올로 50㎖에 녹인다. 완전히 용해시킨 후 2.0㎖를 취하여 4㎖ 바이알에 넣고 0.05N 수산화나트륨에탄올용액 0.5㎖를 넣고 혼합한 후 실온에서 최소 30분 방치하여 표준용액으로 한다(0.167㎎/㎖).

② 시험용액의 조제

총 모나콜린 K로서 1㎎~4㎎이 함유되도록 적당량의 검체를 정밀하게 달아 10㎖ 원심분리관에 넣고 75% 에탄올 10㎖를 넣은 후 잘 흔들어 혼합한 다음 60분간 초음파 처리한다. 실온으로 냉각한 후 3,000rpm에서 10분간 원심분리한 상징액을 0.45㎛ 멤브레인필터로 여과한 것을 시험용액으로 한다.

③ 시험조작

[장치 및 시험조건]

고속액체크로마토그래피(HPLC) 조건

- 칼럼 : 옥타데실실릴화한실리카겔을 충전한 칼럼(ODS칼럼, 4.6㎜×250㎜) 또는 이와 동등 이상의 것

- 검출기 및 파장 : 자외부검출기(UV) 237㎚

- 유속 : 1.0 ㎖/min

- 주입량 : 10㎕

- 이동상 : A액-100% 아세트니트릴, B액-0.2% 인산용액

시간(분)	A(%)	B(%)
0.0	20.0	80.0
10.0	40.0	60.0
15.0	60.0	40.0
20.0	80.0	20.0
24.0	80.0	20.0
25.0	20.0	80.0

[시험방법]

- 정량시험

표준용액과 시험용액을 10㎕씩 주입한 후 상위  HPLC 시험 조건에서 시험한다. 표준용액 중 모나콜린 K와 머무름시간이 일치하는 시험용액 중의 피크를 확인한 후 활성형 모나콜린 K의 함량과 비활성형 모나콜린 K의 함량을 각각 구하고, 각 모나콜린 K의 함량을 합하여 총 모나콜린 K의 함량을 구한다.

[eqn: rmⒶ (비)활성형~모나콜린K(%)=C×{Psa}over{Pst}×{V}over{W}×{1}over{10}]

C : 표준용액의 농도(㎎/㎖)

Psa : 시험용액 중 모나콜린 K의 피크 면적

Pst : 표준용액 중 모나콜린 K의 피크 면적

V : 시험용액의 전량(㎖)

W : 검체량(g)

Ⓑ 총 모나콜린 K(%) = 활성형 모나콜린 K(%) +비활성형 모나콜린 K(%)

(2) 활성형 모나콜린 K 확인시험

상기 (1)의 시험방법에 따라 시험한다.

4. 효모

항목	규격		시험방법
	건조효모	건조효모제품, 효모추출물제품
성상	고유의 색택과 향미를 가지며 이미․이취가 없어야 함		-
조단백질	표시량 이상		제2. 1. 3). (1)
수분(%)	8.0이하	10.0 이하 (단, 액상제품은 제외)	제2. 1. 1)
세균수	—	1㎖당 100 이하 (액상제품에 한함)	제2. 7. 2)
대장균군	음성		제2. 7. 5)

5. 효소

항목	규격	시험방법
성상	고유의 색택과 향미를 가지며 이미․이취가 없어야 함	-
조단백질	표시량 이상	재2. 1. 3). (1)
α-아밀라아제	양성	α-아밀라아제
프로테아제	양성	프로테아제
수분(%)	10.0이하 (단, 액상제품은 제외)	제2. 1. 1)
대장균군	음성	제2. 7. 5)

1) α-아밀라아제

① 장치 및 시약

장치 : Spectrophotometer

㉮ 1% 가용성전분용액 : 가용성전분(최순품) 1g을 물에 녹이고 호화하여 100㎖로 한다.

㉯ 맥바인(Mcllvaine) 완충액(pH 6.0 또는 7.0) : 0.1N 인산일수소나트륨액 일정량에 0.1N 구연산액을 넣어 pH 6.0 및 7.0으로 각각 만든다.

㉰ 0.1% 염화칼슘용액 : 염화칼슘(순품) 1g을 물에 녹여 1ℓ로 한다.

㉱ 요오드시액 : 요오드 0.2g과 요오드칼륨 2g을 물에 녹여 100㎖로 하고 그 1㎖에 1N염산 1㎖를 넣고 물로 100㎖로 한다.

② 시험용액의 조제

검체 5.0g을 정밀히 달아 물 또는 완충액에 녹여 100㎖로 한 다음 여과하여 검액으로 한다. 20㎖ 시험관 2개를 준비하여 각각 시험용, 공시험용으로 한다. 시험용 시험관에 1% 가용성전분용액 5㎖, 맥바인완충액(pH6.0 또는 7.0으로서) 13㎖와 0.1% 염화칼슘용액 1㎖를 넣고 37℃로 가온하고 검액 1㎖를 넣은 후 37℃에서 30분간 방치한다. 별도로 100℃에서 30분간 가열하여 활성을 잃은 검액 1㎖를 위와 같이 조작하여 공시험용으로 한다. 시험용과 공시험용반응액 0.2㎖에 요오드시액 10㎖를 넣은 것을 시험용액으로 한다.

③ 시험조작

물을 대조액으로 하여 액층 1㎝, 파장 660㎚에서 흡광도를 측정한다. 이때 시험용액의 흡광도는 공시험의 흡광도보다 0.030이상 작아야 한다. 발색의 정도가 지나쳐 측정이 곤란한 경우는 검액을 희석하여 시험하고 희석배수를 적용한다.

2) 프로테아제

① 장치 및 시약

장치 : Spectrophotometer

㉮ 0.6% 카제인 용액 : 카제인(최순품)을 건조하여 0.6g을 달아 0.1N 수산화나트륨액 20㎖에 가열하여 녹여서 식힌 다음 0.1M 인산을 넣어 pH 7.0으로 조정하고, pH 7.0 완충액 20㎖를 넣어 100㎖로 한다.

㉯ 0.4M 삼염화초산액 : 삼염화초산(순품) 65.4g을 물에 녹여 1ℓ로 한다.

㉰ 0.4M 탄산나트륨액 : 탄산나트륨(순품) 42.5g을 물에 녹여 1ℓ로 한다.

㉱ 포린시액 : 식품첨가물공전에 따라 만들어 원액으로 한다.

㉲ 완충액 : 0.1M 인산염완충액(pH 6.0 또는 8.0) 또는 0.1M 초산염 완충액(pH 6.0 또는 8.0)

② 시험용액의 조제

검체 약 5.0g을 정밀히 달아 물 또는 완충액에 녹여 100㎖로 한 다음 여과하여 검액으로 한다. 0.6% 카제인용액 1㎖를 시험관에 넣고 37℃의 항온수욕중에서 가온한 다음 여기에 검액 1㎖를 정확히 넣고 잘 흔들어 섞는다. 곧 37℃의 항온수욕중에 넣고 정확히 10분간 반응시킨 다음 여기에 0.4M 삼염화초산액 2㎖를 넣고 다시 37℃에서 25분간 방치한 다음 이것을 여과한다. 여액 1㎖를 시험관에 정확히 취하여 0.4M 탄산나트륨용액 5㎖ 및 포린시액(원액을 3배 희석한 액) 1㎖를 넣어 잘 흔들어 섞는다. 37℃에서 20분간 방치한 다음 발색된 액을 시험용액으로 한다. 이와는 별도로 검액 1㎖를 정확히 취하여 시험관에 넣고 37℃에서 10분간 방치한 후 0.4M 삼염화초산액 2㎖를 넣어서 혼합하고 0.6% 카제인용액 1㎖를 넣어 37℃에서 25분간 방치한 다음 이하 시험용액과 동일하게 조작하여 공시험용액으로 한다.

③ 시험조작

물을 대조액으로 하여 액층 1㎝, 파장 660㎚에서 흡광도를 측정한다. 이때 시험용액의 흡광도는 공시험의 흡광도보다 0.030이상 커야 한다. 발색의 정도가 지나쳐 측정이 곤란한 경우는 검액을 희석하여 시험하고 희석배수를 적용한다.

Ⅷ. 조류

1. 스피루리나

항목	규격		시험방법
	스피루리나원말	스피루리나제품
성상	고유의 색택과 향미를 가지며 이미․이취가 없어야 함		-
조단백질(%)	표시량 이상		제2. 1. 3). (1)
엽록소 a (㎎/100g)	표시량 이상		엽록소 a
수분(%)	7.0 이하	10.0 이하 (단, 액상제품은 제외)	제2. 1. 1)
회분(%)	12.0 이하	—	제2. 1. 2)
총페오포르바이드 (㎎/100g)	100.0 이하	50.0 이하 (스피루리나원말의 양이 50.0%일 때 50.0이하이며, 원말의 배합량에 따라 환산 적용)	제3. Ⅷ. 2. (3)
타르색소	불검출		제2. 4
대장균군	음성		제2. 7. 5)

1) 엽록소 a

① 시험용액의 조제

검체 0.2g을 정밀하게 취하여 유발에 넣고 탄산마그네슘 약 0.1g, 해사 소량을 추가하여 잘 분쇄한 후 85% 아세톤수용액 5㎖를 가하여 추출한다. 추출액은 G3 유리여과기를 사용하여 여과하고, 유리여과기 위의 검체는 녹색을 나타내지 않을 때까지 아세톤으로 수회 세정하여 갈색분액여두에 옮긴다. 이에 사용된 아세톤과 동일한 양의 에틸에테르와 물을 가하여 진탕한다. 정치 후 물층(하층)을 분리하여 여기에 에틸에테르 10㎖를 가하여 추출하는 과정을 2회 반복한 후 에테르층을 합하고 물 30㎖를 가하여 진탕한 후 정치 분리하여 물층을 제거한다. 이 조작을 수회(3회) 반복하여 얻어진 에틸에테르추출액을 갈색삼각플라스크에 옮긴 후 무수황산나트륨 5g을 가하여 약 1시간 방치한 다음 No. 5A 여지를 사용하여 여과하고 250㎖ 밀봉 갈색메스플라스크에 옮기며, 여지 위의 무수황산나트륨은 소량의 에틸에테르로 세정하여 에틸에테르로 250㎖를 채우고 이를 시험용액으로 한다.

② 시험조작

에틸에테르를 대조액으로 액층 1㎝, 파장 642.5㎚와 660㎚에서 시험용액의 흡광도를 측정하고 다음 식에 의해 엽록소 a의 함량을 구한다.

[장치 및 조건]

분광광도계(Spectrophotometer)

[계산식]

엽록소 a 함량(㎎/100g) ＝[eqn: rm { V×(9.93 Abs sub660 — 0.777 Abs sub642.5 )} over { W} × { 100} over { 1,000}]

V∶시험용액의 양(㎖)

W∶검체채취량(g)

Abs660∶660nm에서의 흡광도

Abs642.5∶642.5nm에서의 흡광도

2. 클로렐라

항목	규격		시험방법
	클로렐라원말	클로렐라제품
성상	고유의 색택과 향미를 가지며 이미․이취가 없어야 함		-
조단백질	표시량 이상		제2. 1. 3). (1)
엽록소 (㎎/100g)	표시량 이상
비타민B2 (㎎/100g)	표시량 이상		제2. 10. 2). (3)
철(㎎/100g)	표시량 이상		제2. 10. 1). (4)
엽록소 b	확 인
수분(%)	7.0 이하	10.0 이하 (단, 액상제품은 제외)	제2. 1. 1)
회분(%)	10.0 이하	—	제2. 1. 2)
총페오포르 바이드 (㎎/100g)	80.0 이하	40.0 이하 (클로렐라원말의 양이 50.0%일 때 40.0이하이며, 원말의 배합량에 따라 환산 적용)	제3. Ⅷ. 2. 3)
타르색소	불검출		제2. 4
대장균군	음성		제2. 7. 5)

(1) 엽록소

① 시약조제

알칼리성피리딘용액∶특급 수산화나트륨 1.4g을 물 40~60㎖에 용해하고 특급 피리딘 16.6g을 가한 다음 물을 가하여 100㎖로 한다.

② 시험용액의 조제

검체 5~10㎎(클로렐라건조물로서)을 차광한 공전시험관에 취하고 물 10㎖를 가하여 때때로 흔들어 주면서 30분간 방치한다. 이 현탁액 2.0㎖를 원심분리관에 취하고 알칼리성피리딘용액 5㎖를 가하여 혼합하고 알루미늄호일로 차광하여 60℃ 수욕중에서 때때로 혼합하여 주면서 15분간 방치한 다음 바로 원심분리(3,000rpm, 3분)하여 상등액을 10㎖의 갈색 메스플라스크에 옮겨 차가운 곳에 보관한다. 잔사는 알칼리성피리딘용액 3㎖를 가하여 위의 조작과 똑같이 한 다음 그 상등액을 최초의 상등액에 합하여 알칼리성피리딘용액으로 전량을 10㎖로 맞춘 것을 시험용액으로 한다.

③시험조작

시험용액을 알칼리성피리딘용액을 대조로 하여 액층 1㎝ 파장 419㎚와 454㎚에서 흡광도를 측정하여 다음 식으로 검체 중 엽록소함유량을 구한다. 알칼리성피리딘용액을 가한 후 1시간이내에 조작을 끝낸다.

[장치]

장치 : 분광광도계(Spectrophotometer)

[계산식]

엽록소(mg/100g)＝[eqn: rm { 8.970(7.19E sub 419nm ＋3.33E sub 454nm )} over { S}]×100

S∶원심분리관에서 취한 검체의 중량(㎎)

(2) 엽록소 b

①장치 및 시험조건

- 박층크로마토그래피

- 셀루로스박층판∶TLC plate cellulose precoated(without fluorescent indicator) Art. 5.716 Merck, 20×20㎝, Wako No. 506-00971

- 85% 아세톤∶아세톤(특급) 85㎖에 물을 가하여 100㎖로 한다.

- 전개용매∶석유에테르(비점 50℃~80℃)‧아세톤‧n-프로판올(90∶10∶0.45, v/v/v)

② 시험용액의 조제

검체 약 30㎎(클로렐라원말로서)을 취하여 소량의 85% 아세톤을 가하여 마쇄 후 85% 아세톤 10㎖에 가하여 혼합하여 색소를 추출한다. 이를 원심분리하여 상등액을 감압건조 시킨 후 무수아세톤 1㎖에 용해하여 시험용액으로 한다.

③ 시험조작

시험용액 적당량을 박층판에서 선상으로 도포하여 실온에서 약 30분간 전개시킨다. 엽록소 a의 띠(Blue green) 하부에서 엽록소 b의 띠(Yellow green)를 확인한다.

(3) 총페오포르바이드

① 장치 및 시험조건

분광광도계(Spectrophotometer)

② 시험용액의 조제

검체 100㎎(클로렐라건조물로서)을 정밀히 달아 여기에 차가운 1/15M 인산완충용액(pH 8.0)∶아세톤 혼합(7∶3) 10㎖를 가하고 37℃에서 3시간 항온시킨다. 이어 10% 염산으로 약산성화하고 유발에 넣어 약 0.5g의 해사 및 85%(v/v) 아세톤 20㎖를 가하여 마쇄 후 상등액을 원심분리관으로 옮긴다. 다시 잔사에 아세톤 10㎖씩을 넣어 2회 되풀이하여 조작하고 원심분리관에 합한 다음 원심분리(3,000rpm, 5분)하고, 그 상등액을 에틸에테르 30㎖를 넣은 분액여두로 옮긴다. 에틸에테르와 아세톤 혼합액에 5% 황산나트륨용액 50㎖를 가하여 약하게 흔들어 주고 황산나트륨 층을 버린다. 이와 같은 이 세척 조작을 3회 반복한 후 무수황산나트륨을 가하여 탈수하여 에틸에테르층을 취한 다음 에틸에테르로 전량을 50㎖로 하여 이를 색소원액으로 한다. 이 색소원액 20㎖를 취하여 17% 염산 20㎖, 10㎖씩을 넣고 차례로 흔들어 추출한 후 염산층을 취한다. 포화황산나트륨용액 150㎖와 에틸에테르 20㎖를 넣고 흔들어 추출한 후 에틸에테르층을 분취하고 여기에 에틸에테르를 가하여 전량을 20㎖로 한 것을 시험용액으로한다.

③ 시험조작

에틸에테르를 사용하여 시험용액을 필요한 농도로 정확하게 희석하여 667㎚의 파장에서 흡광도를 측정한다. 총페오포르바이드의 함량을 페오포르바이드의 667㎚ 비흡광계수 70.2(0.1% 용액 1㎝)로 하여 계산한다.

[계산식]

총페오포르바이드(mg/100g)＝[eqn: rm { A} over { 70.2}× { 100} over { S} × { 50} over { 20} ×D]

A∶흡광도

D∶희석배수

S∶검체 채취량(g)

Ⅸ. 기타

1. 버섯류

항목	규격	시험방법
성상	고유의 색택과 향미를 가지며 이미․이취가 없어야 함	-
자실체(%)	표시량 이상 (버섯자실체제품에 한하며, 추출물의 경우 자실체의 건조물로 환산)	자실체 또는 균사체 함량
균사체(%)	표시량 이상 (버섯균사체제품에 한하며, 추출물의 경우 균사체 배양물의 건조물로 환산)	자실체 또는 균사체 함량
확인시험	자실체 또는 균사체가 확인
수분(%)	7.0이하(단, 액상제품은 제외)	제2. 1. 1)
타르색소	불검출	제2. 4
대장균군	음성	제2. 7. 5)

(1) 자실체 또는 균사체의 확인 및 함량

① 영지버섯제품

㉮ 산성클로로포름 가용분에 의한 확인 및 정량

Ⓐ 검체 및 표준물질의 조제

㉠ 검체의 조제

제품 약 10g(추출물은 자실체로 환산하여)을 정밀히 달아 삼각플라스크네 취하고 물 100㎖를 가해 냉각관을 부착한 고무마개를 하여 90~100℃에서 4시간 환류하여 추출한 후 추출물은 가온하여 녹인다. 이에 에탄올 100㎖를 가해 잘 흔들어 섞은 후 여과한다. 잔류물을 물 : 에탄올(1:1) 200㎖로 30분간 진탕하여 추출한다. 여액을 합하여 감압농축하여 전량을 10㎖이하로 한다.

농축물을 물 200㎖에 분산하여 2N 염산으로 pH3으로 한 후 클로로포름 50㎖씩으로 3회 추출한다. 클로로포름층을 합하여 미리 무게를 구해놓은 플라스크에 옮기고, 클로로포름을 감압하에 날려보내고, 잔류물을 데시케이터(실리카겔)중에서 24시간 건조한 후 그 무게를 구하고 조제 검체로 한다.

㉡ 표준물질의 조제

해당제품의 원료 자실체 건조물을 분쇄 또는 가늘게 썰거나 배양물의 건조물 약 10g을 정밀히 달아 삼각플라스크에 취하고 물 100㎖를 가하여 냉각관을 부착한 고무마개를 하여 90~100℃에서 4시간 환류하여 추출하고(추출물은 가온하여 녹인다.) 이에 에탄올 100㎖를 가해 잘 흔들어 섞은 후 여과한다. 잔류물은 물 : 에탄올(1:1) 200㎖로 30분간 진탕하여 추출한다. 여액을 합하여 감압하에 농축하여 전량을 10㎖이하로 한다. 농축물을 물 200㎖에 분산하여 2N 염산으로 pH 3으로 한 후 클로로포름 50㎖씩으로 3회 추출한다. 클로로포름층을 합하여 5% 탄산수소나트륨수용액 50㎖씩으로 3회 추출한다. 물층을 합하여 2N 염산으로 pH 3으로 조정하여 클로로포름 50㎖씩으로 3회 추출한다. 클로로포름층을 합하여 미리 무게를 구해놓은 플라스크에 옮기고, 클로로포름을 감압하에 날려보내고 잔류물을 데시케이터(실리카겔)중에서 24시간 건조한 후 그 무게를 구한다.

Ⓑ 확인시험

제품의 산성클로로포름 추출에 의해 얻은 검체 3~10㎎을 정확히 달아 내부 표준용액 1㎖를 정확히 가해 검액으로 한다. 별도로 원료 영지건조물에서 산성클로로포름 추출에 의해 얻은 표준물질 3~10㎎을 정확히 달아 내부표준용액 1㎖를 정확히 가해 표준용액으로 한다.

검액 및 표준용액 10㎕씩을 다음의 조건하에서 고속액체크로마토그래피하여 얻은 검액의 크로마토그램 및 표준용액의 크로마토그램은 동일한 특유의 양상(패턴)이 확인되어야한다.

㉠ 고속액체크로마토그래피 조건㎖

ⓐ 자실체 가공제품의 경우

- 내부표준용액∶티몰의 에탄올 용액(1㎎/㎖)

- 검출기∶자외흡광광도계(측정파장 254nm)

- 칼럼∶내경 4㎜, 길이 25~30㎝의 스테인레스관에 5~10㎛의 옥타데실화 실리카겔(μꠀBondapak C18 상당품)을 충전한 것

- 칼럼온도∶40℃

- 이동상∶2% 초산수용액‧아세토니트릴(2∶1)

- 유량∶티몰의 머무름시간이 약 40분이 되도록 조정한다.

- 칼럼의 선택∶표준용액 10㎕에 대해 상기 조건에서 조작할 때 산성클로로포름 가용물, 내부표준물질의 순으로 용출되고 내부표준물질에 대한 분리계수가 약 2.7이 되는 피크의 물질<가노데린산 A(Ganoderic acid A)>과 내부표준물질의 분리도가 2.0 이상의 것을 사용한다.

ⓑ 배양물을 가공한 제품의 경우

- 내부표준용액∶파이렌의 에탄올 용액(10μg/㎖ )

- 검출기∶자외흡광광도계(측정파장∶210nm)

- 칼럼∶내경 4㎜, 길이 25~30㎝의 스테인레스관에 5~10㎛의 옥타데실화 실리카겔(μꠀBondapak C18 상당품)을 충전한 것

- 칼럼온도∶실온

- 이동상∶(pH 6.5 인산이수소칼륨, 인산수소이나트륨완충액)‧에탄올의 혼액(9:20)

- 유량∶파이렌의 머무름 시간이 약 30분이 되도록 조정한다.

- 칼럼의 선택∶표준용액 10㎕에 대해 상기조건에서 조작할 때 산성클로로포름 가용물, 내부표준물질의 순으로 용출되고 내부표준물질에 대한 분리계수가 약 1.7이 되는 피크의 물질<가노데린산 S(Ganoderic acid S)>과 내부표준물질의 분리도가 6.0 이상의 것을 사용한다.

Ⓒ 정량시험

㉠ 자실체 또는 배양물을 가공한 제품의 경우

검체 및 표준물질의 조제에서 얻어진 산성클로로포름 가용분의 중량을 사용하여 다음식에 의거하여 구한다.

영지함유율(건조환산율 %)=

[eqn: rm {{검체의~산성클로로포름~가용분(㎎)}over{검체채취량(g)}}over{{표준물질의~산성클로로포름~가용분(㎎)}over{표준자실체~또는~표준배양물의~건조물량(g)}}}×100]

㉡ 자실체와 배양물을 혼합하여 가공한 제품의 경우

확인시험에 의해 얻은 검체 및 표준물질의 액체크로마토그램의 내부표준물질이 피크 면적에 대한 지표물질(자실체에 있어서는 가노데린산 A배양물에 있어서는 가노데린산 S)의 피크 면적비와 QtA, QsA 및 QtS, QsS를 구하여 다음 식에 의거 계산한다.

영지의 함유율(건조물 환산율)(%)

＝ <영지자실체 함유율(M)>＋<영지배양물함유율(N)>

M＝[eqn: rm { Q sub t A(조제검체)/(검체 채취량(g)} over {Q subs A(표준물질)/표준자실체 건조물량(g)} ×100]

N＝[eqn: rm { Q sub t S(조제검체)/(검체채취량(g)} over { Q subs S(표준물질)/"표준배양물의 건조물량(g)"}]×100(%)

② 운지버섯제품

㉮ 산성클로로포름가용분에 의한 확인 및 정량

Ⓐ 검체 및 표준물질의 조제

㉠ 검체의 조제

제품 약 10g(추출물은 자실체로 환산하여)을 정밀히 달아 삼각플라스크에 취하고, 물 100㎖를 가해 냉각관을 부착한 고무마개를 하여 90~100℃에서 4시간 환류하여 추출한 후(추출물은 가온하여 녹인다) 에탄올 100㎖를 가해 잘 흔들어 섞은 후 여과한다. 잔류물을 물∶에탄올(1∶1) 200㎖로 30분간 진탕하여 추출한다. 여액을 합하여 감압하에 농축하여 전량을 10㎖ 이하로 한다. 농축물을 물 200㎖에 분산하여 2N 염산으로 pH 3으로 한 후 클로로포름 50㎖씩으로 3회 추출한다. 클로로포름층을 합하여 5% 탄산수소나트륨용액 50㎖씩으로 3회 추출한다.  물층을 합하여 2N 염산으로 pH 3으로 조정하여 클로로포름 50㎖씩으로 3회 추출한다. 클로로포름층을 합하여 미리 무게를 구해놓은 플라스크에 옮겨 클로로포름을 감압 하에 날려 보내고, 잔류물을 데시케이터(실리카겔)중에서 24시간 건조한 후 그 무게를 구하고 이를 조제검체로 한다.

㉡ 표준물질의 조제

해당 제품의 원료 자실체 건조물의 분말 또는 배양물의 건조물 약 10g을 정밀히 달아 삼각플라스크에 취하고 물 100㎖를 가하여 냉각판을 부착한 고무마개를 하여 90~100℃에서 4시간 환류하여 추출한 후(추출물은 가온하여 녹인다) 이에 에탄올 100㎖를 가해 잘 흔들어 섞은 후 여과한다. 잔류물은 물∶에탄올(1∶1) 200㎖로 30분간 진탕하여 추출한다. 여액을 합하여 감압 하에 농축하여 전량을 10㎖이하로 한다. 농축물을 물 200㎖에 분산하여 2N 염산으로 pH3으로 한 후 클로로포름 50㎖씩으로 3회 추출한다. 클로로포름층을 합하여 5% 탄산수소나트륨용액 50㎖씩으로 3회 추출한다. 물층을 합하여 2N 염산으로 pH 3으로 조정하여 클로로포름 50㎖씩으로 3회 추출한다. 클로로포름층을 합하여 미리 무게를 구해놓은 플라스크에 옮겨 클로로포름을 감압 하에 날려 보내고, 잔류물을 데시케이터(실리카겔)중에서 24시간 건조한 후 그 무게를 구하여 이를 조제표준물질로 한다.

Ⓑ 확인시험

제품의 산성클로로포름 추출에 의해 얻은 조제검체 3~10㎎을 정밀히 달아 내부표준용액 1㎖를 정확히 가해 검액으로 한다. 별도로 원료운지버섯의 산성클로로포름 추출에 의해 얻은 조제표준물질 3~10㎎을 정확히 달아 내부표준용액 1㎖를 정확히 가해 표준용액으로 한다.

검액 및 표준용액 10㎕씩을 다음의 조건하에 고속액체크로마토그래프를 할때 검액의 크로마토그램 및 표준용액의 크로마토그램은 동일한 특유의 양상(패턴)이 확인되어야 한다.

㉠ 고속액체크로마토그래피 조건

- 내부표준용액∶티몰의 에탄올 용액(1㎎/㎖)

- 검출기∶자외흡광광도계(측정파장 254nm)

- 칼럼∶내경 4㎜, 길이 25~30㎝의 스테인레스관에 5~10㎛의 옥타데실화실리카겔(μꠀBondapak C18 상당품)을 충전한 것

- 칼럼온도∶40℃

- 이동상∶2% 초산수용액∶아세토니트릴(2∶1)

- 유량∶티몰의 머무름시간이 약 40분이 되도록 조정한다.

Ⓒ 정량시험

검체 및 표준물질의 조제에서 얻어진 산성클로로포름 가용분의 중량을 사용하여 다음식에 의거 함량을 구한다.

운지자실체 또는 균사체(건조물환산율)(%)=

[eqn: rm {{검체의~산성클로로포름~가용분(㎎)}over{검체채취량(g)}}over{{표준물질의~산성클로로포름~가용분(㎎)}over{표준자실체~또는~표준배양물의~건조물량(g)}}}×100]

③ 표고버섯제품

㉮ 장치

Ⓐ 전개조∶200㎜×200㎜ 유리판의 사용이 가능한 유리재질로 기밀한 것

Ⓑ 실리카겔박층판∶박층크로마토그래피용 실리카겔 30g에 물 50㎖를 가하여 섞은 후 유리판(200㎜×200㎜)에 0.3~0.5㎜의 두께로 도포한다. 풍건 후 105~110℃에서 3시간 건조하고 데시케이터중에서 방냉하여 보존한다.

Ⓒ 자외선등(365nm)∶탁상형 또는 휴대형

㉯ 시약

Ⓐ 무수에탄올(특급)

Ⓑ 1N 암모니아용액∶농암모니아수(28%) 67㎖를 취하여 물을 가해 1L로 한다.

Ⓒ 0.5N 초산용액∶초산(특급) 29㎖를 취해 물을 가해 1l로 한다.

Ⓓ 전개용매∶nꠀ부탄올(특급), 초산(특급), 증류수를 4∶1∶2(용량비)로 혼합한다.

Ⓔ 이온교환수지∶Amberlite IRꠀ120B(H형), Amberlite IRAꠀ45(OH형)

Ⓕ 닌히드린용액∶물로 포화시킨 nꠀ부탄올에 닌히드린(특급)을 용해하여 0.2%로 한 용액

㉰ 표준용액의 조제

Ⓐ 표준물질의 조제∶원료인 건조표고버섯 및 관리배양한 표고균사 10g을 정확히 달아 삼각플라스크에 취하고 10배량의 물을 가해 냉각관을 부착한 고무마개를 하여 90~100℃에서 4시간 환류하여 추출하고 추출액을 모아 감압농축하여 액량을 20㎖로 한다.

Ⓑ 표준용액의 조제∶표준물질에 4배량의 무수에탄올을 가해 80% 에탄올용액으로 하고 생성한 침전을 원심분리하여 제거한다. 상등액을 감압농축하여 에탄올을 제거하고, 분액여두에 옮겨 동량의 에테르로 2회 추출하고 그 에테르층을 제거한다. 에테르를 완전히 제거한 후 물층에 10g의 Amberlite IRꠀ120B(H형)을 가해 30분간 진탕하여 흡착시킨다. 흡착된 수지를 물로 세척한 후 1N NH4OH를 20㎖ 가하여 30분간 진탕하여 용출시킨다. 용출 후 10g의 Amberlite IRAꠀ45(OH형)을 가하고 30분간 진탕하여 흡착시킨다. 흡착시킨 수지를 물로 씻어낸 후 0.5N CH3COOH 20㎖로 30분간 흔들어서 용출시킨 후 이것을 2~3회 반복하여 용출액을 모아 감압농축하여 전량을 1㎖로 하여 표준용액으로 한다.

㉱ 시험용액의 조제

Ⓐ 검체의 조제∶원료표고버섯 자실체 또는 인공적으로 관리배양한 균사의 가공분말 또는 이들을 가공한 제품의 경우에는 원료의 10g에 해당하는 제품을 정확히 달아 삼각플라스크에 취하고 10배량의 물을 가해 냉각관이 부착된 고무마개를 하여 90~100℃에서 4시간 환류하여 추출하고 추출액은 합하여 감압농축하여 액량을 20㎖로 한다. 단, 원료가 표고버섯의 자실체 및 인공적으로 관리배양한 균사의 추출물인 경우에는 원료 10g 상당의 제품에 20㎖의 물을 가해 용해 또는 현탁한다.

Ⓑ 시험용액의 조제∶③ 표준용액의 조제 Ⓑ 표준용액의 조제와 동일한 방법으로 실험하여 시험용액을 준비한다.

㉲ 시험조작

표준용액 및 시험용액을 실리카겔박층판(200㎜×200㎜)에 각각 20㎕씩 직경 3~5㎜로 점적한 후 전개조에서 전개시킨다. 전개된 실리카겔박층판은 풍건한 후 닌히드린용액을 분무하여 90~100℃에서 수분간 가열하여 발색한 후 발색부에 자외선(365nm)를 조사하여 형광의 반점(Elidadenin)을 비교 확인한다. 별도로 조작하여 얻은 박층판의 동일 반점부위를 긁어모아 에탄올 일정량을 가하여 추출하고 원심 분리하여 액층 1㎝, 파장 253.6nm에서 흡광도를 측정하여 함량을 구한다.

2. 화분

항목	규격			시험방법
	화분	화분추출물	화분제품, 화분추출물제품
성상	고유의 색택과 향미를 가지며 이미․이취가 없어야 함			-
조단백질(%)	표시량 이상			제2. 1. 3). (1)
수분(%)	8.0 이하	8.0 이하 (단, 액상제품은 제외)	10.0 이하 (단, 액상제품은 제외)	제2. 1. 1)
타르색소	불검출			제2. 4
대장균	음성			제2. 7. 5)

3. 프로폴리스추출물

항목	규격	시험방법
성상	고유의 색택과 향미를 가지며 이미․이취가 없어야 함	-
총플라보노이드 (%)	표시량 이상	총플라보노이드
확인시험(ρ-쿠마르산, 계피산, 플라보노이드)	확인	확인시험
수분(%)	10.0 이하 (프로폴리스추출물에 한하며, 액상제품은 제외)	제2. 1. 1)
납(㎎/㎏)	5.0 이하	제2. 5. 3). (2)
디에틸렌글리콜	불검출	디에틸렌글리콜
대장균	음성	제2. 7. 5)

1) 총플라보노이드

(1) 장치 및 시험조건

분광광도계, 원심분리기, 50㎖용 메스플라스크, 50㎖원심관, 시험관(∮18㎜×180㎝)

[시약조제]

쿼세친(Quercetin)(시약특급), 에탄올(시약특급)

10% 질산알루미늄용액∶질산알루미늄[Al(NO3)3.‧9H2O](시약특급) 17.6g을 정확히 달아 물로 용해하여 100㎖로 한다.

1M-초산칼륨액∶초산칼륨(CH3COOK) 9.815g을 칭량하여 물로 용해하여 100㎖로 한다.

(2) 시험용액의 조제

과립상, 정제상의 제품은 우선 시료를 충분히 파쇄하여 사용한다. 또한 젤라틴 등을 피포한 제품은 내용물을 꺼내어 사용한다.

Ⓐ 프로폴리스추출물

검체 60~100㎎을 칭량하고 90% 에탄올 20㎖를 가해 용해, 원심분리(3,000rpm, 10min)한다.

상등액을 취하고 잔류물을 80% 에탄올 8㎖로 3회 추출하고 전추출액을 합하여 80% 에탄올을 사용하여 전량을 50㎖로 해서 시험용액으로 한다.

Ⓑ 프로폴리스추출물제품

검체 1~6g(㎖)(프로폴리스추출물로 60~100㎎에 상당하는 양)을 칭량하고 90% 에탄올 20㎖를 가하여 상기 Ⓐ의 방법으로 조작한다. 다만, 당을 포함한 경우는 검체(프로폴리스추출물 60~100㎎에 상당하는 양)를 정평하고 물 10㎖로 용해하고 에탄올 10㎖를 가하여, 원심분리(3,000rpm, 10min)를 행한다.

상등액을 취하고 잔류물을 80%에탄올 8㎖로 3회 조작하고 전 추출액을 합하여 80% 에탄올을 사용하여 전량을 50㎖로 해서 시험용액으로 한다.

(3) 시험조작

시험용액 0.5㎖를 시험관에 취하고 에탄올 1.5㎖, 10% 질산알루미늄용액 0.1㎖, 1M 초산칼륨용액 0.1㎖, 물 2.8㎖를 가하여 충분히 교반을 한다. 실온에서 40분간 정치 후 액층을 10㎜ 셀(cell)을 사용하여 물을 대조액으로 하여 415㎚에서 흡광도를 측정한다.

시료의 흡광도로부터 별도로 상기 조작 중 질산알루미늄용액 대신 물 0.1㎖를 가한 것의 흡광도를 뺀 흡광도 차를 이용하여 아래 ④항에서 작성한 검량선에 의하여 총플라보노이드 a ㎎/㎖를 산출한다.

아래의 ⑤ 계산식에 의해 프로폴리스추출물 함량을 구한다.

검량선의 작성

쿼세친을 무수물로 혼합하여 50㎎을 정확히 달아 에탄올을 넣어 용해하고 정확히 50㎖가 되게 한다. 이 용액에 에탄올을 가하여 100, 20, 10배로 희석하고 0.01, 0.05, 0.1㎎/㎖의 각 표준용액을 조제하고 상기 조작에 준하여 흡광도를 구하여 검량선을 작성한다. 각각의 농도마다 공시험을 한다.

[계산식]

총플라보노이드 함량(w/w %, 또는 w/v %)=

[eqn: rm a~mg/㎖ ×{{50㎖} over{검체의 채취량(g 또는 ㎖)×1,000(㎎)}}×100]

2) 플라보노이드, ρ-쿠마르산, 계피산 확인시험

①플라보노이드의 확인

검체 1g(㎖)에 80% 에탄올 9㎖를 가하여 용해하고 필요하면 여과하여 시험용액으로 한다. 시험용액 2㎖에 마그네슘조각(리봉) 20㎎ 및 20% 염산 5방울을 가해 방치하고 등색(橙色) 또는 적색을 확인한다. 필요하면 소량의 물로 용해한 후 99.9% 에탄올을 가하여 전체 용량을 9㎖로 한다.

② ρ-쿠마르산(Coumaric acid), 계피산(Cinamic acid)의 확인

프로폴리스추출물 또는 프로폴리스추출물가공식품을 1g(㎖)을 정확히 달아 80% 에탄올로 희석하고 용해하여 20㎖로 정용한다. 그 용액을 0.5㎛의 멤브레인 필터로 여과하여 여과액 5㎕를 다음과 같은 조건으로 실험하여 얻은 크로마토그램에서 표준 쿠마르산 또는 계피산과 동일한 유지시간의 피크를 확인한다.(필요하면 소량의 물로 용해한 후 99.5%의 에탄올을 가하여 전체용량을 20㎖로 한다).

[장치 및 시험조건]

- 액체 크로마토그래피 조건의 예

- 칼    럼∶ODS 칼럼 150㎜×∮6㎜ 또는 이와 동등한 것

- 칼럼온도∶60℃

- 이 동 상∶물∶메탄올∶초산＝60∶75∶5

- 유    량∶1㎖/min

- 주 입 량∶5㎕

- 검 출 기∶자외부 분광광도계(275㎚)

- ρ-쿠마르산용액∶ρ-쿠마르산(시약특급) 100㎎을 정확히 달아 80% 에탄올로 용해하고 100㎖로 정용한다.

- 계피산용액∶계피산(시약특급) 100㎎을 정확히 달아, 80%에탄올로 용해하고 100㎖로 정용한다.

2) 디에틸렌글리콜

(1) 정량시험

① 표준용액의 조제

DEG(diethylene glycol)표준용액 : DEG 100㎎을 메탄올에 녹여 100㎖로 하고 그 5㎖를 취하여 메탄올로 100㎖가 되게 한다. 검량선을 작성할 때는 이 표준용액을 메탄올로 희석하여 사용한다.

② 시험용액의 조제

분말 또는 페이스트상의 시료는 1g을 취하여 메탄올 10㎖를 가하여 녹이고, 액상시료는 5㎖를 40℃에서 감압농축시켜 수분을 제거한 후 잔사에 메탄올 10㎖를 가하여 녹여 이 액을 알루미나칼럼에 가하여 메탄올 30㎖로 용출한다. 용출액을 40℃에서 약 1㎖로 감압농축시켜 메탄올을 가하여 5㎖로 한 후 시험용액으로 한다.

② 시험조작

[장치 및 시험조건]

① 가스크로마토그래피에 의한 정량시험조건

Ⓐ일반글라스에 의한 측정

- 칼럼 : 내경 3㎜, 길이 1.5m, 글라스제

- 충전제 : 20% PEG 20M, Chromosorb W(AW-DMCS), 80~100메쉬

- 주입부온도 : 250℃

- 칼럼온도 : 205℃

- 검출기온도 : 250℃

- 캐리어가스 및 유량 : 질소 40㎖/min

- 주입량 : 4㎕

- 검출기 : 수소염이온화검출기(FID)

- 정량시험 : 얻어진 DEG의 높이 또는 넓이를 구하여 검량선을 작성한 후 DEG를 정량한다.

Ⓑ 모세관 칼럼(capillary column)에 의한 측정

- 칼럼 : 50% phenyl methyl silicon으로 충전된 내경 0.52㎜, 길이 10㎜의 컬럼

- 주입구온도 : 140℃

- 칼럼온도 : 90℃

- 검출기온도 : 250℃

- 캐리어가스 및 유량 : 질소(N2) 6㎖/min

- 주입량 : 2㎖

- 검출기 : 수소염이온화검출기(FID)

- 정량시험 :  얻어진 DEG의 높이 또는 넓이를 구하여 검량선을 작성한 후 DEG를 정량한다.

② 가스크로마토그래프 - 질량분석법(GC-MS법)에 의한 확인

- 가스크로마토그래피 질량분석기(GC/MS)를 사용한다. DEG의 m/z 45, m/z 75를 검출할 수 있는 것이어야 한다.

- 칼럼 : fused 실리카(methyl silion)로 크로스링크되어 있는 내경 0.20㎜, 길이 12.5m의 모세관 칼럼

- 칼럼온도 : 280℃

- 주입구온도 : 280℃

- 캐리어가스 : 헬륨 0.75㎏/㎠

- split ratio : 1/30

- 이온화전류 : 300μA

- 주입량 : 1㎕

- 정성 및 정량시험 : DEG의 m/z 45 이온과 m/z 75 이온에 의한 크로마토그램과 DEG에 상당하는 피크의 크로마토그램을 비교하여 확인한다. 시험용액을 1/4로 농축하면 5ppm까지 확인할 수 있다.

제4장 시약․시액․표준용액 및 용량분석 규정용액

따로 규정이 없는 한 시험에 쓰는 시약‧시액‧표준용액 및 용량분석용 표준용액은 다음의 규격에 맞는 것을 쓴다.

시약‧시액‧표준용액 및 용량분석용 표준용액을 보존하는 유리용기는 용해도 및 알카리도가 매우 낮고 납 및 비소를 될 수 있는대로 함유하지 아니하는 것을 쓴다.

1. 시약

시약은 따로 표시하지 아니한 것은 모두 최순품을 쓴다.

과망간산칼륨  KMnO4

과산화수소  H2O2

구연산  C6H8O7‧H2O

구연산암모늄  (NH4)2HC6H5O7

규조토

글리세린  C3H8O3

α-나프틸아민  C10H7‧NH2

N-1-나프틸에틸렌디아민염산염  C10H7NH(CH2)2NH2‧HCl

뉴트랄레드  C15H17N4Cl

데히드로초산나트륨  C8H7O4Na‧H2O

둘신  C9H12N2O2

n-디메틸아미노벤즈알데히드  (CH3)2N‧C2H4CHO

디아스타아제

디에틸디티오카바민산나트륨  (C2H5)2NCS2Na‧3H2O

디에틸포름아미드  (C2H5)2NCOH

디티존  C6H6NHNHCSN‧NC6H5

레소르신  C6H6C2

로다민B  C28H31ClN2O3

메틸렌블루  C16H18N3ClS

메틸레드  C15H15O2N3

메틸바이오렛  C25H30ClN3

메타인산  HPO3 35%이상

메탄올  CH3OH 95v/v%이상

무수삼산화비소  삼산화비소‧무수와 같다.

무비소아연  아연‧무비소와 같다.

무비소염산  염산‧무비소와 같다.

무수아황산나트륨  아황산나트륨‧무수와 같다

무수에탄올  에탄올‧무수와 같다.

무수초산나트륨  초산나트륨‧무수와 같다.

무수탄산나트륨  탄산나트륨‧무수와 같다.

무수탄산칼륨  탄산칼륨‧무수와 같다.

무수황산나트륨  황산나트륨‧무수와 같다.

무수황산동  황산동‧무수와 같다.

바닐린  C6H3CHO(OCH3)OH

벤젠  C6H6 95 v/v%이상

n-부탄올  CH3(CH2)2CHOH

붕산  H3BO3 99.5%

브롬티몰블루  C27H28O5Br2S

브롬크레졸그린  C21H14O5Br4S

브롬크레졸퍼플  C21H16O5Br4S

브롬페놀블루  C19H10O4Br4S

브롬화제이수은  HgBr2

브루신  C23H21N2O4

빙초산  CH3COOH 99~100%

사상아연  아연‧사상과 같다.

사염화탄소  CCl4

사카린나트륨  C7H4NNaO3S‧2H2O

산화마그네슘  MgO

살리실산  HOC6H4COOH

삼산화비소‧무수  As2O3

삼염화요오드  ICl3

석유벤젠

석유에테르

설파닌산 C6H7NO3S

설파민  C6H8O2N2S

소르빈산나트륨  C6H7O2Na

수산  H2C2O4‧2H2O 99.8%이상

수산나트륨  Na2C2O4(표준시약) 110℃에서 3시간 보존한 후 데시케이터(황산)에서 식힌다.

수산암모늄  (NH4)2C2O4‧H2O

수산화나트륨  NaOH

수산화칼륨  KOH

승화요오드  요오드‧승화와 같다.

승화황  황‧승화와 같다.

시안화칼륨  KCN

식용색소녹색제2호  C37H34O9N2S3Na2

식용색소녹색제3호  C37H34O10N2S3Na2

식용색소자색제1호  C39H40O6N3S2Na

식용색소적색제2호  C20H11O10N2S3Na3

식용색소적색제3호  C20H6O5I4Na2‧H2O

식용색소청색제1호  C37H34O2N2S3Na2

식용색소청색제2호  C16H18O2S2Na2

식용색소황색제4호  C16H9O9N4S2Na3

식용색소황색제5호  C16H10O7N2S2Na2

실리카겔G  박층크로마토그래피용

실리콘수지

싸이클라민산나트륨  C6H11NHSO3Na

아밀알코올  C6H11OH

아밀알코올‧이소  아밀알코올과 같다.

아세톤  CH3COCH3

아연‧분말  Zn

아연‧사상  Zn

아연‧입상  Zn

아연‧무비소  Zn

아질산나트륨  NaNO2

아황산나트륨‧무수  Na2SO3

아황산수소나트륨  NaHSO3

안식향산나트륨  C7H5O2Na

알룸  황산알루미늄칼륨과 같다.

암바라이트  IR-120(H)

야자유

에틸렌디아민테트라초산나트륨  C10H14N2Na2O8‧2H2O

에틸에테르  C2H5OC2H5

에탄올  C2H5OH 95%이상

에탄올‧무수  C2H5OH 99.5%이상

에스테르  에틸에테르와 같다.

염기성푹신

염산  HCl

염산‧회 염산 23.6㎖에 물을 넣어 100㎖로 한다. HCl 9.5~10.5 w/v%

염화나트륨  NaCl

염화나트륨(표준시약) NaCl 500~650℃에서 40~50분간 가열한 다음 데시케이터(황산)에서 식힌다.

염화바륨  BaCl2

염화암모늄  NH4Cl

염화제이수은  HgCl2

염화제이철  FeCl3‧6H2O

염화제일주석  SnCl2‧2H2O

요오드  I2

요오드‧승화  I2

요오드산칼륨  KIO3

요오드화나트륨  NaI

요오드화아연  ZnI2

요오드화칼륨  KI

유동파리핀  파라핀‧유동과 같다.

이소아밀알코올  아밀알코올과 같다.

이소프로판올  (CH3)2CHOH

이황화탄소  CS2

인산  H3PO4

입상아연  아연‧입상과 같다.

전분(약전품)

주석산  C4H6O6

주석산나트륨  Na2C4H4O6‧2H2O

주석산칼륨나트륨  KNaC4H4O6‧4H2O

질산  HNO3

질산‧희  질산 10.5㎖에 물을 넣어 100㎖로 한다.

질산납  Pb(NO3)2

질산수은  Hg(NO3)2‧H2O

질산알루미늄  Al(NO3)3

질산암모늄  NH4NO3

질산은  AgNO3

질산칼륨  KNO3

철‧환원  Fe

초산  CH3COOH 35%

초산‧빙  빙초산과 같다.

초산‧희  CH3COOH 6%

초산나트륨  CH3COONa‧3H2O

초산나트륨‧무수  CH3COONa

초산납  Pb(CH3COCO)2‧3H2O

초산아연  Zn(CH3COO)2‧2H2O

초산암모늄  CH3COONH4

초산에틸  CH3COOC2H5

초산제이동  Cu(CH3COO)2‧H2O

티몰블루  C27H30O5S

티오황산나트륨  Na2S2O3‧5H2O

카카오지

크로모트로프산  크로모트로산디나트륨과 같다.

크로모트로프산디나트륨  (HO)2C10H4(SO2Na)2

크롬산칼륨  K2CrO4

크리스탈바이오  메틸바이오와 같다.

클로로포름  CHCl3

키실렌  C6H4(CH3)2

탄산나트륨  Na2CO3‧10H2O

탄산나트륨  Na2CO3(표준시약) 500~650℃에서 40~50분간 가열한 다음 데시케이터(황산)에서식힌다.

탄산나트륨‧무수  Na2CO3

탄산수소나트륨  NaHCO3

탄산칼슘  CaCO3

탈지면(약전품)

톨루엔  C6H5CH3

1‧1‧2-트리클로로에탄  CH2ClCHCl2

파라옥시안식향산부틸  C11H14O3

파라핀‧유동

판크레아틴

페놀레드  C19H14O5S

페놀프탈레인  C20H14O4

페로시안화칼륨  K4Fe(CN)6

포르말린  HCHO 35.0~37.0를 함유한다.

푹신‧염기성  염기성푹신과 같다.

피리딘  C5H5N

피크린산  HOC6H2(NO2)3

헥사민  C6H12N4

활성탄

황‧승화  S

황산  H2SO4

황산‧희  H2SO4‧10%

황산나트륨  Na2SO4‧10H2O

황산나트륨‧무수  Na2SO4

황산동  CuSO4‧5H2O

황산동‧무수  CuSO4

황산마그네슘  MgSO4‧7H2O

황산알루미늄칼륨  KAl(SO4)2‧12H2O

황화제이철  Fe2(SO4)3‧3H2O

황산칼륨  K2SO4

황화나트륨  Na2S‧9H2O

황화수소  H2S

휘발유  무색투명하고 납이 함유되지 아니한 것

묽은염산  염산‧희와 같다.

묽은질산  질산‧희와 같다.

묽은초산  초산‧희와 같다.

묽은황산  황산‧희와 같다.

2. 시액

강암모니아시액：암모니아시액강과 같다.

뉴트랄레드시액：뉴트랄레드 0.1g을 빙초산에 녹여 100㎖로 한다.

뉴트랄레드‧브롬티몰블루혼합시액：뉴트랄레드시액 및 브롬티몰블루혼합시액의 같은 량을 섞는다.

레소르신시액  레소르신 1g을 염산에 녹여 100㎖로 한다.

메틸렌블루시액  메틸렌블루 0.1g을 에탄올 100㎖로 녹이고 필요하면 여과한다.

메틸레드시액  메틸레드 0.1g을 에탄올 100㎖에 녹이고 필요하면 여과한다.

메틸바이오렛시액  메틸바이오렛 0.1을 물 100㎖에 녹이고 필요하면 여과한다.

메틸오렌지시액  메틸오렌지 0.1을 물 100㎖에 녹이고 필요하면 여과한다.

바닐린황산시액  바닐린 0.5g을 황산에 녹여 100㎖로 한다.

벨트란시액A  황산동의 순수한 결정 40g을 물에 녹여 1,000㎖로 한다.

벨트란시액B  주석산칼륨나트륨 200g 및 수산화나트륨 150g을 물에 녹여 1,000㎖로 한다.

벨트란시액C  황산제이철(과망간산칼륨액을 환원하여서는 아니된다) 50g을 적당량의 물에 녹여 황산 200㎖를 가하고 식힌 후 물을 가하여 1,000㎖로 한다.

벨트란시액D  과망간산칼륨 5g을 물에 녹여 1,000㎖로 한다.

표정

수산암모늄 0.2500g을 물 100㎖에 녹이고 황산 2㎖를 가하여 60~70℃로 가열한 후 과망간산칼륨액으로 적정하고 그 적정량을 a ㎖라고 하면 이 액 1㎖는 Cu 0.2238/ag에 대응한다.

브롬티몰블루시액  브롬티몰블루 0.1g의 희에탄올(1＋1) 100㎖에 녹이고 필요하면 여과한다.

브롬크레졸그린시액  브롬크레졸그린 50㎎을 에탄올 100㎖에 녹이고 필요하면 여과한다.

브롬크레졸그린‧메틸레드혼합시액  브롬크레졸그린시액 및 메틸레드시액의 같은 양을 섞는다.

브롬페놀블루시액  브롬페놀블루 0.1g을 희에탄올(1＋1) 100㎖에 녹이고 필요하면 여과한다.

알루미나(Alumina)크림

냉포화명반(Alum) 수용액에 리트머스지로 알카리성이 될 때까지 암모니아수를 가하여 침전을 얻고 이 침전을 염화바륨시액으로 황산이온 반응이 나타나지 않을 때까지 경사법으로 씻고 과량의 물을 버리고 잔류크림을 밀전하여 보존한다.

알코올성수산화칼륨시액  7.5w/v% 수산화칼륨용액 40㎖를 물 40㎖에 녹이고 에탄올을 가하여 1,000㎖로 한다.

암모니아시액  암모니아시액‧강 10㎖에 물을 가하여 30㎖로 한다.

암모니아시액‧강  암모니아수(28%이상)

야자유비누액

정제야자유 50g, 에탄올 50㎖ 및 75w/v% 수산화칼륨용액 20㎖를 200㎖의 삼각플라스크에 넣고 환류냉각기를 달아 조용히 가열하여 투명한 비누액으로 한 후 10분간 끓인다. 다음 에탄올을 날려 보내고 잔류한 비누액을 110℃의 건조기에서 에탄올 냄새가 없어질 때까지 건조한 후 물에 녹여 500㎖로 한다.

염기성초산납용액  종성초산납 330g을 물 500㎖에 녹이고 산화납 110g을 혼합하여 저어 섞으면서 30분간 끓인 후 식히고 상징액을 기울여 분리하여 사용한다.

염화바륨시액  염화바륨 12g을 물에 녹여 100㎖로 한다.

염화제이철시액  염화제이철 5g에 염산 5㎖ 및 물을 넣어 용해하여 100㎖로 한다.

요오드화칼륨시액  요오드화칼륨 16.5g을 물에 녹여 100㎖로 한다. 이 액은 차광하여 보존한다.

황화나트륨시액

황화나트륨 5g을 물 10㎖ 및 글리세린 30㎖의 혼액에 녹인다. 또는 수산화나트륨 5g을 물 30㎖ 및 글리세린 90㎖의 혼액에 녹여, 그 반용량에 차가울 때 황화수소를 포화시키고 여기에 나머지 반용량을 혼합시킨다.

차광한 병에 거의 가득 채워서 보존하고 만든 다음 3개월 이내에 사용한다.

위스시액

① 요오드 13g을 빙초산 1ℓ에 녹이고 그 10㎖를 취하여 0.1N 티오황산나트륨용액으로 적정하여 요오드의 농도를 결정하여 둔 다음 요오드용액에 정제 건조염소가스를 통하여 암갈색에서 담등황색으로 변할 때 이를 중지하고 이 액 10㎖를 취하여 요오드화칼륨 10㎖ 및 물 10㎖를 가하여 잘 섞고 0.1N 티오황산나트륨액으로 적정하여 이 측정치가 정확히 먼저의 측정치의 2배가 되도록 한다.

측정치가 2배가 되지 않으면 염소가스를 더 통하고 2배가 넘으면 소량 남겨둔 요오드용액을 가하여 조절한다.

② 삼염화요오드 7.9g과 요오드 8.7g을 따로 따뜻한 빙초산에 녹인 후 혼합하여 이에 빙초산을 가하여 1,000㎖로 한다.

① 또는 ②의 어느 방법에 의하여 만들어 사용하여도 좋으나 갈색병에 밀전하여 어두운 곳에 보존한다.

전분시액

전분 1g을 찬물과 잘 섞고 이를 열탕 200㎖에 저어 섞으면서 천천히 가하고 액이 반투명하게 될 때까지 끓이고 방냉 정치한 다음 상징액을 사용한다.

정제에텔

적당량의 에테르를 분액깔때기에 취하여 새로 만든 2%황산제일철용액을 에테르의 약 1/5용량 가하고 잘 흔들어 섞은 후 물층을 버린다. 이 조작을 2%황산제일철용액의 물층이 황갈색을 나타내지 않을 때까지 되풀이하고 에테르의 약 1/5 용량의 물로 2～3회 씻은 후 에틸층을 분취하여 무수황산나트륨을 넣고 탈수한다. 다음 에테르를 증류플라스크에 옮기고, 분류관을 붙여 증류한다. 초유액 약 10%를 버리고 플라스크내의 에테르가 약 10%정도 남게 유액을 받아 밀전차광용기에 넣고 황산제일철(결정) 및 수산화나트륨(입상)을 각각 소량씩 넣어 냉암소에 보관한다.

이 액은 사용할 때 만든다.

중성초산납포화용액  중성초산납 250g을 물 500㎖에 녹여 여과한다.

산 또는 알카리를 함유할 때는 수산화나트륨용액 또는 초산으로 중화한다.

질산수은시액

염화제이수은 또는 질산제이수은을 물에 녹이고 이에 수산화나트륨용액을 소량씩 저어 섞으면서 가하여 산화제이수은을 완전히 침전시키고 감압 여과하여 침전물을 물로 여러번 씻은 후 그 1～2g을 비커에 취하고 질산은을 가하여 녹인 다음 30% 수산화나트륨용액을 소량씩 적가하여 과잉의 질산을 중화한다. 이 때 새로 생긴 산화제이수은의 침전이 완전히 녹지 않게 될 때까지 물을 가하여 15～25㎖로 한다. 침전을 가라앉힌 다음 상징액을 사용한다. 이 액은 산성이면 아니 된다.

초산시액(1N)  빙초산 5.8㎖에 물을 가하여 100㎖로 한다.

티몰블루시액  티몰블루 0.1g을 에탄올 100㎖에 녹이고 필요하면 여과한다.

카레스(Carrez)침전제  제1액 15%페로시안화칼륨용액, 제2액 30%황산아연용액

크롬산칼륨시액  크롬산칼륨 10g에 물을 가하여 100㎖로 한다.

페놀레드시액  페놀레드 0.1g을 에탄올 100㎖에 녹이고 필요하면 여과한다.

페놀프탈레인시액	페놀프탈레인 1g을 에탄올 100㎖에 녹인다.

페링시액A액

황산동(CuSO4‧5H2O) 34.64g을 물에 녹여 500㎖로 한다음 다음과 같이 표정하여 둔다.

A액 10㎖를 350㎖의 삼각플라스크에 취하고 물 40㎖, 30% 초산용액 4㎖ 및 50% 요오드화칼륨용액 6㎖를 가하고 유리한 요오드를 전분시액을 지시액으로 하여 0.1N 티오황산나트륨으로 적정한다.

F =[eqn: rm{6.354×A×f} over {174.8}]

F ：A액의 역가

A：0.1N 티오황산나트륨액의 소비량(㎖)

f ：0.1N 티오황산나트륨액의 역가, 이 역가는 1±0.005로 조정한다.

페링시액B액  주석산칼륨나트륨 173g과 수산화나트륨 50g에 물을 가하여 500㎖로 한다.

3. 표준용액

데히드로초산표준용액

데히드로초산 100㎎을 정확히 취하여 0.1N 수산화나트륨액 6㎖에 녹인 후 물을 가하여 100㎖로 하고, 그 20㎖를 정확히 취하여 물을 가하여 1,000㎖로 한다.

데히드로초산표준용액 1㎖ ＝ 20㎍ 데히드로초산

둘씬표준용액  둘씬 20㎎을 에탄올 15㎖에 녹인다.

싸이클라민산표준용액  싸이클라민산나트륨 50㎎을 물 5㎖에 녹인다.

사카린표준용액  사카린나트륨 50㎎을 물 5㎖에 녹인다.

살리실산표준용액

살리실산 100㎎을 정확히 취하여 0.1N 수산화나트륨액 8㎖에 녹인 후 물을 가하여 100㎖로 하고, 그 25㎖를 정확히 취하여 물을 가하여 1,000㎖로 한다.

살리실산표준용액 1㎖ ＝ 25㎍ 살리실산

소르빈산표준용액

소르빈산 100㎎을 정확히 취하여 0.1N 수산화나트륨액 9㎖에 녹인 후 물을 가하여 100㎖로 하고 그 5㎖를 정확히 취하여 물을 가하여 1,000㎖로 한다.

소르빈산표준용액 1㎖ ＝ 5㎍소르빈산

색소표준용액

수용성 산성착색료는 0.05～0.1% 수용액을 사용하고 염기성색소는 0.05～0.5%수용액을 사용하고, 유용성색소는 0.05～0.5%의 에탄올용액이나 사염화탄소용액을 사용한다.

안식향산표준용액

안식향산 100㎎을 정확히 취하여 0.1N 수산화나트륨액 8.5㎖에 녹인 후 물을 가하여 100㎖로 하고 그 10㎖를 정확히 취하여 물을 가하여 1,000㎖로 한다.

안식향산표준용액 1㎖ ＝ 10㎍ 안식향산

파라옥시안식향산표준용액

파라옥시안식향산 100㎎을 정확히 취하여 0.1N 수산화나트륨액 9㎖에 녹인 후 물을 가하여 100㎖로 하고 그 10㎖를 정확히 취하여 물을 가하여 1,000㎖로 한다.

파라옥시안식향산표준용액 1㎖ ＝ 10㎍ 파라옥시안식향산

휴젤유표준용액

휴젤유 또는 이소아밀알코올 1g을 무수에탄올에 녹인 후 물을 가하여 1,000㎖로 한다.

휴젤유표준용액 1㎖ ＝ 1㎎ 휴젤유

4. 용량분석용 규정용액

0.1N 과망간산칼륨액

1,000㎖ 중 KMnO4 3.1608g을 함유한다.

과망간산칼륨 약 3.3g을 물에 녹여 1,000㎖로 하고 15분간 끓인 다음 밀전한 플라스크에 넣어 적어도 2일간 방치하고 석면으로 여과한다.

표  정

수산나트륨(표준시약)을 300℃에서 1시간 건조하고 데시케이터(황산)에서 식히고 그 약 0.3g을 정밀히 달아 500㎖의 비커에 넣고 물 30㎖를 넣어 10~15분간 끓인 다음 27±3℃로 식히고 황산(1→20) 250㎖를 넣어 녹인다. 과망간산칼륨액을 유리콕크가 있는 뷰렛에 넣고 천천히 저으면서 40㎖를 1분간에 25~30㎖의 속도로 넣어 액의 홍색이 없어질 때까지 방치하고 55~60℃로 가열하여 탈색한 다음 적정을 계속한다. 30초동안 지속하는 엷은 홍색을 나타낼 때까지 적정을 계속한다. 단, 종말점 전의 0.5~1㎖는 과망간산칼륨액의 색이 없어진 다음에 계속 한방울씩 적가하도록 주의하여야 한다.

0.1N 과망간산칼륨액 1㎖  ＝  6.700㎎ Na2C2O4

이 액은 차광하여 보존하고 오래되면 다시 표정한다.

0.01N 과망간산칼륨액

사용할 때 0.1N 과망간산칼륨액을 물로 정확히 10배 용량으로 희석한다.

0.1N 수산액

1,000㎖중 C2H2O4 4.502g을 함유한다.

수산 6.45g을 물에 녹여 1,000㎖로 한다.

차광한 공전병에 보존한다.

새로 표정한 0.1N 과망간산칼륨액으로 0.1N 과망간산칼륨에 따라 표정한다.

0.01N 수산액

0.1N 수산액을 정확히 10배 용량으로 희석한다.

1N 수산화나트륨액

1,000㎖중 NaOH 39.999g을 함유한다.

수산화나트륨 45g을 물 약 950㎖에 녹이고 이에 새로 만든 수산화바륨포화용액을 침전이 그 이상 생기지 않을 때까지 가한다. 액을 잘 섞은 다음 밀전하고 하루밤 방치한다. 상징액을 기울이거나 여과하여 다음 방법으로 표정한다. 이 액은 고무전으로 밀전하거나 또는 소다석회관을 단 병에 보존한다. 가끔 다시 표정하여 사용하지 않으면 아니된다. 1N 염산 또는 1N 황산 25㎖를 취하여 새로 끓여 식힌 물 50㎖로 희석하여 수산화나트륨액으로 적정한다(지시액：페놀프탈레인시액 두방울).

0.1N 수산화나트륨액

1N 수산화나트륨액을 취하여 새로 끓여 식힌 물로 10배 용량으로 희석하거나 수산화나트륨 약 4.5g을 취하여 1N 수산화나트륨액에 따라 만들고 표정하여 보존한다.

이 액은 가끔 다시 표정하여야 한다.

0.02N 수산화나트륨액

0.1N 수산화나트륨액을 취하여 새로 끓여 식힌 물로 5배 용량으로 희석한다.

1N 수산화나트륨액에 따라 표정하여 보존한다.

이 액은 가끔 다시 표정하여야 한다.

0.01N 수산화나트륨액

0.1N 수산화나트륨액을 취하여 새로 끓여 식힌 물로 10배 용량으로 희석한다.

1N 수산화나트륨액에 따라 표정하여 보존한다.

이 액은 가끔 다시 표정하여야 한다.

1N 수산화칼륨액

1,000㎖중 KOH 56.108g을 함유한다.

수산화칼륨 약 70g을 취하여 1N 수산화나트륨액에 따라 만들고 표정한다.

0.1N 수산화칼륨액

1N 수산화칼륨액을 새로 끓여 식힌 물로 10배 용량으로 희석하거나 수산화칼륨 약 7g을 취하여 1N 수산화칼륨액에 따라 만들고 표정한다.

0.02N 아황산수소나트륨액

아황산수소나트륨 0.5g을 물에 녹여 500㎖로 하고 갈색병에 보존한다.

이 용액은 약 1주일간 사용할 수 있다.

0.5N 알코올성수산화칼륨액

1,000㎖중 KOH 28.054g을 함유한다.

수산화칼륨 약 35g을 물 20㎖에 녹이고 에탄올(알데히드 없는 것)을 가하여 1,000㎖로 하고 밀전한 용기에 넣어 24시간 이상 방치한 다음 상징액을 다른 병에 옮기고 밀전‧차광하여 보존한다.

표  정

0.5N 염산 25㎖를 취하여 물 50㎖를 가하고 이 알코올성수산화칼륨액으로 적정한다(지시액：페놀프탈레인시액 두방울).

1N 염산

1,000㎖중 HCl 36.465g을 함유한다.

염산 95㎖를 물로 희석하여 1,000㎖로 하고 다음 방법으로 표정한다.

미리 약 270℃에서 1시간 건조한 탄산나트륨(표준시약) 약 1.5g을 정밀히 달아 물 100㎖에 녹이고 이 염산으로 적정한다(지시액：브롬페놀블루시액 두방울). 다만, 종말점 부근에서 한번 끓여 이산화탄소를 날려 보낸 다음 곧 적정을 계속한다.

1N염산 1㎖  ＝  52.99㎎ Na2CO3

0.5N 염산

염산 47.5㎖를 취하여 1N 염산에 따라 만들고 표정한다.

0.5N 염산 1㎖ ＝ 26.50㎎ Na2CO3

0.1N 염산

1N염산을 물로 10배 용량으로 희석하거나 염산 9.5㎖를 취하여 1N 염산에 따라 만들고 표정한다.

0.1N 염산 1㎖ ＝ 5.299㎎ Na2CO3

0.1N 요오드액

1,000㎖중 I2 12.691g을 함유한다.

요오드 약 14g에 요오드화칼륨 36g을 물 100㎖에 녹인 액에 녹이고 염산 3방울 및 물을 가하여 1,000㎖로 하고 다음 방법으로 표정한다.

이 액은 공전병에 보존하고 가끔 다시 표정하여야 한다.

표  정

삼산화비소(표준시약)를 분말로 하여 100℃에서 항량이 될 때까지 건조한 다음 그 약 0.15g을 정밀히 달아 이를 1N 수산화나트륨액 20㎖에 필요하면 가열하여 녹인다. 다음 이에 물 약 40㎖ 및 메틸오렌지시액 두방울을 가하고 다시 액의 황색이 담홍색으로 될 때까지 희염산을 가한다.

이에 탄산수소나트륨 2g, 물 약 50㎖ 및 전분시약 3㎖를 가하고 요오드액으로 이 액이 청색이 지속될 때까지 적정한다.

0.1N 요오드액 1㎖ ＝ 4.946 gAs2O3

이 액은 차광하여 보존하고 오래된 것은 다시 표정하여 사용한다.

0.02N 요오드액

0.1N 요오드액을 물로 5배 용량으로 희석하여 0.1N 요오드에 따라 표정하여 보존한다.

0.01N 요오드액

0.1N 요오드액을 물로 10배 용량으로 희석하여 0.1N 요오드액에 따라 표정하여 보존한다.

0.1N 질산은액

1,000㎖중 AgNO3 16.988g을 함유한다.

질산은 약 17.5g을 물 1,000㎖에 녹이고 다음과 같이 표정한다. 염화나트륨(표준시약)을 500～650℃에서 1시간 건조하고 황산데시케이터에서 식힌 다음 약 150㎎을 정밀히 달아 물 50㎖에 녹여 크롬산칼륨시액 1㎖를 넣고 질산은액으로 엷은 적갈색을 나타낼 때까지 적정한다.

0.1N 질산은액 1㎖ ＝ 5.844㎎ NaCl, 이 액은 차광하여 보존하여야 한다.

0.02N 질산은액

사용할 때 0.1N 질산은액에 물을 가하여 정확히 5배 용량으로 희석한다.

0.01N 질산은액

사용할 때 0.1N 질산은액에 물을 가하여 정확히 10배 용량으로 희석한다.

0.1N 티오황산나트륨액

1,000㎖중 Na2S2O3 15.812g을 함유한다.

티오황산나트륨 약 26g 및 무수탄산나트륨 0.2g을 새로 끓여 식힌 물에 녹여 1,000㎖로 한다. 이 액은 가끔 다시 표정하여야 한다.

표  정

이 액으로 0.1N 요오드액을 적정하거나 다음 방법으로 표정한다.

요오드산칼륨(표준시약)을 120～140℃로 2시간 건조하고 데시케이터(황산)에서 식히고 그 약 100㎎을 정밀히 달아 밀전한 병에 넣고 물 25㎖에 녹인 다음 요오드화칼륨 2g 및 희황산 10㎖를 넣고 마개를 꼭 막고 10분간 방치한 다음 물 100㎖를 넣고 유리된 요오드를 티오황산나트륨액으로 적정한다.

이 때 종말점 부근에서 액이 담황색으로 되었을 때 전분시액 3㎖를 넣고 생성된 청색이 탈색될 때까지 적정한다. 같은 방법으로 공시험을 하여 보정한다.

0.1N 티오황산나트륨액 1㎖ ＝ 3.567㎎ KIO3

0.01N 티오황산나트륨액

0.1N 티오황산나트륨액을 새로 끓여 식힌 물로 10배 용량으로 희석하고 0.1N 티오황산나트륨액에 따라 사용할 때 표정한다.

1N 황산

1,000㎖중 H2SO4 49.04g을 함유한다.

물 약 1,000㎖를 저으면서 이에 황산 30㎖를 천천히 가하여 20℃가 될 때까지 식히고 1N 염산의 표정에 따라 탄산나트륨(표준시약)으로 표정한다.

1N 황산 1㎖ ＝ 52.996mg Na2CO3

0.1N 황산

1N 황산을 물로 10배 용량으로 희석하거나 황산 3㎖로 1N 황산에 따라 만들고 표정한다. 0.1N황산 1㎖ ＝ 5.299㎎ Na2CO3

제5장 부표

1. 레인‧에이논 전화당 정량표

검액의 소요량 (㎖)	검액 100㎖ 중의 전화당 량(㎎)	검액의 소요량 (㎖)	검액 100㎖ 중의 전화당 량(㎎)	검액의 소요량 (㎖)	검액 100㎖ 중의 건화당 량(㎎)
16.0 16.1 16.2 16.3 16.4 16.5 16.6 16.7 16.8 16.9 17.0 17.1 17.2 17.3 17.4 17.5 17.6 17.7 17.8 17.9 18.0 18.1 18.2 18.3 18.4 18.5 18.6 18.7 18.8 18.9 19.0 19.1 19.2 19.3	316.6 314.7 312.7 310.8 308.9 307.0 305.2 303.4 301.5 299.8 298.0 296.4 294.8 293.2 291.6 290.0 288.4 286.8 285.2 283.6 282.0 280.5 279.0 277.5 276.0 274.5 273.0 271.5 270.0 268.5 267.0 265.7 264.5 263.2	19.4 19.5 19.6 19.7 19.8 19.9 20.0 20.1 20.2 20.3 20.4 20.5 20.6 20.7 20.8 20.9 21.0 21.1 21.2 21.3 21.4 21.5 21.6 21.7 21.8 21.9 22.0 22.1 22.2 22.3 22.4 22.5 22.6 22.7	262.0 260.7 259.5 258.2 257.0 255.7 254.5 253.3 252.2 251.0 249.9 248.7 247.5 246.5 245.2 244.1 242.9 241.8 240.7 239.6 238.5 237.4 236.2 235.1 234.0 232.9 231.8 230.8 229.9 228.9 228.0 227.0 226.0 225.1	22.8 22.9 23.0 23.1 23.2 23.3 23.4 23.5 23.6 23.7 23.8 23.9 24.0 24.1 24.2 24.3 24.4 24.5 24.6 24.7 24.8 24.9 25.0 26.0 27.0 28.0 29.0 30.0 31.0 32.0 33.0 34.0 35.0	224.1 223.2 222.2 221.3 220.4 219.5 218.6 217.8 216.9 216.0 215.1 214.2 213.3 212.4 211.6 210.7 209.9 209.0 208.2 207.3 206.4 205.6 204.8 197.4 190.4 183.7 177.6 171.0 166.3 161.2 156.0 152.2 147.9

2. 레인‧에이논 유당 정량표

검액의 소요량 (㎖)	검액 100㎖ 중의 무수유 당량(㎎)	좌의 유당량이 전화 후 전화 당으로서 나타 내는 양(㎎)	검액의 소요량 (㎖)	검액 100㎖ 중의 무수유 당량 (㎎)	좌의 유당량이 전화 후 전화 당으로서 나타 내는 양(㎎)
25.0 25.1 25.2 25.3 25.4 25.5 25.6 25.7 25.8 25.9 26.0 26.1 26.2 26.3 26.4 26.5 26.6 26.7 26.8 26.9 27.0 27.1 27.2 27.3 27.4 27.5	258.0 257.0 256.0 255.0 254.0 253.0 252.0 251.0 250.0 249.0 248.0 247.1 246.1 245.2 244.2 243.3 242.3 241.4 240.4 239.5 238.5 237.7 236.8 236.0 235.1 234.3	207.3 206.5 205.7 205.0 204.2 203.3 202.5 201.7 201.0 200.1 299.3 198.6 197.9 197.2 196.4 195.7 194.9 194.2 193.5 192.7 192.0 191.4 190.7 190.1 189.3 188.8	27.6 27.7 27.8 27.9 28.0 28.1 28.2 28.3 28.4 28.5 28.6 28.7 28.8 28.9 29.0 29.1 29.2 29.3 29.4 29.5 29.6 29.7 29.8 29.9 30.0 30.1	233.4 232.6 231.7 230.9 230.0 229.2 228.4 227.7 226.9 226.1 225.3 224.5 223.8 223.0 222.2 221.5 220.7 220.0 219.2 218.4 217.7 216.9 216.2 215.4 214.7 214.0	188.0 187.4 186.7 186.1 185.3 184.7 184.1 183.5 182.9 182.3 181.5 180.9 180.3 179.7 197.1 178.4 177.8 177.3 176.7 176.1 175.5 174.8 174.3 173.7 173.1 172.6

검액의 소요량 (㎖)	검액 100㎖ 중의 무수유 당량(㎎)	좌의 유당량이 전화 후 전화 당으로서 나타 내는 양(㎎)	검액의 소요량 (㎖)	검액 100㎖ 중의 무수유 당량 (㎎)	좌의 유당량이 전화 후 전화 당으로서 나타 내는 양(㎎)
30.2 30.3 30.4 30.5 30.6 30.7 30.8 30.9 31.0 31.1 31.2 31.3 31.4 31.5 31.6 31.7 31.8 31.9 32.0 32.1 32.2 32.3 32.4 32.5 32.6	213.3 212.6 211.9 211.2 210.5 209.8 209.2 208.4 207.8 207.2 206.5 205.9 205.2 204.6 203.9 203.3 202.6 202.0 201.3 200.7 200.1 199.5 198.9 198.3 197.7	172.1 171.5 170.9 170.4 169.9 169.4 168.8 168.3 167.7 167.2 166.7 166.2 165.7 165.2 164.7 164.1 163.6 163.1 162.6 162.1 161.6 161.2 160.7 160.1 159.6	32.7 32.8 32.9 33.0 33.1 33.2 33.3 33.4 33.5 33.6 33.7 33.8 33.9 34.0 34.1 34.2 34.3 34.4 34.5 34.6 34.7 34.8 34.9 35.0	197.1 196.5 195.9 195.3 194.7 194.2 193.6 193.1 192.5 191.9 191.4 190.8 190.3 189.7 189.2 188.6 188.1 187.5 187.0 186.5 185.9 185.4 184.8 184.3	159.1 158.7 158.2 157.7 157.3 156.8 156.3 155.8 155.3 154.9 154.4 154.0 153.5 153.0 152.6 152.2 151.8 151.4 151.0 150.6 150.3 149.9 149.4 149.0

3. 벨트란 당류 정량표

당류 (㎎)	각 당류에 상당하는 동 중량(㎎)					당류 (㎎)	각 당류에 상당하는 동 중량(㎎)
	전화당	포도당	갈 락 토오스	맥아당	유당		전화당	포도당	갈 락 토오스	맥아당	유당
10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33	20.6 22.6 24.6 26.5 28.5 30.5 32.5 34.5 36.4 38.4 40.4 42.3 44.2 46.1 48.0 49.8 51.7 53.6 55.5 57.4 59.3 61.1 63.0 64.8	20.4 22.4 24.3 26.3 28.3 30.2 32.2 34.2 36.2 38.1 40.1 42.0 43.98 45.8 47.7 49.6 51.5 53.4 55.3 57.2 59.1 60.9 62.8 64.6	19.3 21.2 23.0 24.9 26.7 28.6 30.5 32.3 34.2 36.0 37.9 39.8 41.6 43.4 45.2 47.0 48.9 50.7 52.5 54.4 56.2 58.0 59.7 61.5	11.2 12.3 13.4 14.5 15.1 16.7 17.8 18.9 20.0 21.1 22.2 23.3 24.4 25.5 26.6 27.7 28.9 30.3 31.1 32.2 33.3 34.4 35.5 36.5	14.4 15.8 17.2 18.6 20.0 21.4 22.8 24.2 25.6 27.0 28.4 29.8 31.1 32.5 33.9 35.2 36.6 38.0 39.4 40.7 42.1 43.4 44.8 46.1	34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57	66.7 68.5 70.3 72.2 74.0 75.9 77.7 79.5 81.2 83.0 84.8 86.5 88.2 90.0 91.8 93.6 95.4 97.1 98.8 100.6 102.2 104.0 105.7 107.4	66.5 68.3 70.1 72.0 73.8 75.7 77.5 79.3 81.1 82.9 84.7 86.4 88.2 90.0 91.8 93.6 95.4 97.1 98.9 100.6 102.3 104.0 105.8 107.6	63.3 65.0 66.8 68.6 70.4 72.1 73.9 75.6 77.4 79.1 80.8 82.5 84.3 86.6 87.7 89.5 91.2 92.9 94.6 96.3 98.0 99.7 101.5 103.2	37.6 38.7 39.8 40.9 41.9 430 44.1 45.2 46.3 47.4 48.5 49.5 50.6 51.7 52.8 53.9 55.0 56.1 57.1 58.2 59.3 60.3 61.4 62.5	47.4 48.7 50.1 51.4 52.7 54.1 55.4 56.7 58.0 59.3 60.6 61.9 63.3 64.6 65.9 67.2 68.5 69.8 71.1 72.4 73.7 74.9 76.2 77.5

당류 (㎎)	각 당류에 상당하는 동 중량(㎎)					당류 (㎎)	각 당류에 상당하는 동 중량(㎎)
	전화당	포도당	갈 락 토오스	맥아당	유당		전화당	포도당	갈 락 토오스	맥아당	유당
58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79	109.2 110.9 112.6 114.3 115.9 117.6 119.2 120.9 122.6 124.2 125.9 127.5 129.2 130.8 132.4 134.0 135.6 137.2 138.9 140.5 142.1 143.7	109.3 111.1 112.8 114.5 116.2 117.9 119.6 121.3 123.0 124.7 126.4 128.1 129.8 131.4 133.1 134.7 136.3 137.9 139.6 141.2 142.8 144.5	104.9 106.6 108.3 110.0 111.6 113.3 115.0 116.6 118.3 120.0 121.7 123.3 125.0 126.6 128.3 130.0 131.5 133.1 134.8 136.4 138.0 139.7	63.5 64.6 65.7 66.8 67.9 68.9 70.0 71.1 72.2 73.0 74.0 75.4 76.5 77.6 78.6 79.7 80.8 81.8 82.9 84.0 85.1 86.1	78.8 80.1 81.4 82.7 83.9 85.2 86.5 87.7 89.0 90.3 91.6 92.8 94.1 95.4 96.9 98.0 99.1 100.4 101.7 102.9 104.2 105.4	80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100	145.3 146.9 148.5 150.0 151.6 153.2 154.8 156.4 157.9 159.5 161.1 162.6 164.2 165.7 167.3 168.8 170.3 171.9 173.4 175.0 176.5	146.1 147.7 149.3 150.9 152.5 154.0 155.6 157.2 158.3 160.4 162.0 163.6 165.2 166.7 168.3 169.9 171.5 173.1 174.6 176.2 177.8	141.3 142.9 144.6 146.2 147.8 149.4 151.1 152.7 154.0 156.0 157.6 159.2 160.8 162.4 164.0 165.6 167.2 168.8 170.4 172.0 173.6	87.2 88.3 89.4 90.4 91.5 92.6 93.7 94.8 95.8 96.9 98.0 99.0 100.1 101.1 102.2 103.2 104.2 105.3 106.3 107.4 108.4	106.7 107.9 109.2 110.4 111.7 112.9 114.1 115.4 116.6 117.9 119.1 120.3 121.6 122.8 124.0 125.2 126.5 127.7 128.9 130.2 131.4

4. 난수표

	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25	95767 81934 64959 88488 22306 01436 35962 80319 32141 99197 04030 99835 26400 64363 82878 19485 72762 53747 84760 42365 44336 52930 50436 24980 94186	26878 99378 10235 81729 61346 13553 90832 01462 01977 78637 88194 54210 63946 11259 87304 82792 47963 17433 29591 42338 05322 61970 54490 54548 95540	94971 73901 55441 60733 09026 53487 21604 60338 57874 67636 08580 80413 83204 59066 33618 88195 14380 51614 96142 66105 04540 05808 50650 49428 75071	75204 46997 87439 84690 66275 19706 29620 69763 25052 35765 86080 82015 36388 92948 19490 31877 96130 97763 02207 03782 75989 22807 59386 91704 10076	64775 11173 04966 94315 78204 30740 01151 32812 11567 36871 76119 07459 30497 72291 88779 74902 74633 90426 79847 83727 51385 85460 25572 86913 10263	52647 80744 96170 10841 11563 83272 81945 84076 35505 22555 62260 93910 24021 31804 38883 13212 21388 47833 89559 14200 52279 22723 23267 92940 27664	35672 51957 22582 99296 67457 69602 61894 10555 04797 94013 81248 93694 93962 82029 14481 02514 22096 58245 66803 57263 16661 61318 44039 86923 98534	97456 50801 13512 47844 69438 99251 91583 88707 21900 15118 51732 41184 25555 15789 77089 47152 24987 14890 15461 85617 91446 23281 08759 22428 81171	89815 25785 60227 87998 98753 81599 41133 92309 81703 81620 89078 65698 00357 04683 58544 17292 50056 77303 39639 95577 48811 63426 33702 47877 61507	16767 40475 81391 01066 23478 79264 83955 34505 11848 76730 21940 31977 93441 34455 22761 62081 26487 35338 23187 88654 25346 69030 34580 20510 74976	1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25

	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
26 27 28 29 30	12359 57132 71239 03935 72801	46569 49387 49511 83975 73777	11050 74792 07466 28893 79101	90529 50937 15364 66615 26592	49289 62339 86050 14015 45424	94545 43401 31093 22410 00899	02258 82825 16730 90938 78462	20678 03692 73587 35961 74336	18898 37836 79875 36373 60478	50931 68752 43576 84810 13852	26 27 28 29 30
31 32 33 34 35	80252 69388 40225 59925 31172	11587 92356 60304 62338 89780	10862 81282 13526 78784 95384	11627 33832 47601 63228 51947	89857 56676 12751 82603 13841	07788 35132 19233 31755 74371	46817 07119 02057 72733 81016	55863 27613 28447 80303 39798	35713 01304 46676 91066 26690	44712 70032 29541 52537 00978	31 32 33 34 35
36 37 38 39 40	45587 37819 51402 93873 97645	42590 60911 74213 99143 51836	08443 94740 01105 82254 11835	20404 05536 15098 53647 99276	15100 94042 61470 11010 86466	74747 17969 23047 68668 67647	50642 36747 28521 25888 60834	34480 92151 58559 36209 30704	68080 07501 59305 65412 06711	23169 67660 08761 00066 11128	36 37 38 39 40
41 42 43 44 45	13123 72110 13751 83809 46264	15323 70217 40714 98109 57933	24885 23475 99330 48292 37607	74046 48152 05232 06947 58926	49145 83457 97056 15924 60772	99982 01585 40788 08787 62523	48231 90915 70005 03919 66260	26711 69308 36274 72577 95270	87670 89090 78649 12906 46469	22062 77158 50897 80694 45110	41 42 43 44 45
46 47 48 49 50	97426 74715 92481 40176 90176	78630 09140 55828 70724 19360	06115 90315 20144 99476 74015	44047 03927 77853 34567 89080	42350 82118 18100 10214 36337	88455 00800 13196 97743 40242	61426 14314 12279 15770 39621	08812 06984 20903 78474 71369	04255 88951 01252 75691 72350	87718 10983 00731 59930 73430	46 47 48 49 50

※ 난수표 사용방법

아래의 그림과 같이 농산물이 든 상자가 가로, 세로, 높이 각 10개씩 1,000상자가 쌓여 있다고 할 때 난수표를 사용하여 검체를 채취할 상자를 선정하는 것을 설명하면 다음과 같다.

① 임의로 한 상자를 선택한다.

예：임의로 왼쪽 끝의 위에서 두 번째 상자를 선택하였다면 위 그림의 “가”에 해당된다.

② 난수표의 한 지점을 임의로 선택한다.

예：임의로 난수표의 한 지점을 선택한 결과 3번 칸, 25번 줄 위치에 있는 다섯 숫자(7 5 0 7 1)중에서 네번째 숫자인 7을 선택하였다.

③ 난수표에서 선택한 숫자로부터 임의로 가로, 세로 또는 위, 아래 방향으로 세 개 숫자를 읽는다.

예：선택된 숫자인 7로부터 가로 방향으로 읽기로 했다면 7, 1, 1로 읽혀진다.

④ 읽혀진 숫자에 따라 세 방향으로 상자를 세어 검체채취할 상자를 선정한다.

예：오른쪽, 위의, 안쪽으로 숫자를 세기로 하였다면 위 그림에서 오른쪽으로 7번째, 윗쪽으로 1번째, 안쪽으로 1번째에 있는 상자 즉, 위 그림의 “나”가 검체를 채취할 상자가 된다.

5. 검체채취내역서

① 검 사 의 뢰 번 호		② 건강기능 식품명
		③ 제 조 번 호 또 는 유 통 기 한
④ 채 취 일 자	년 월 일 시 분	⑤ 채 취 량
⑥ 채 취 목 적	○ 감시계획 ○ 조사연구 ○ 기타( )	⑦ 건강기능 식품종
		⑧ 검 사 항 목
⑨ 검 체 채 취 시 보관 및 운반상 태	○ 실온 ○ 냉장 ○ 냉동 ○ 기타( )	⑩ 채 취 자	소속：
			성명 (인)
		⑪ 인 수 자	소속：
			성명 (인)
※ 기타 정밀검사 시 참고할 사항

부  칙(2006.    .    )

제1조(시행일) 이 고시는 고시한 날부터 시행한다.

제2조(경과조치) ①